ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 19371.2—2007 代替GB/T19371.2—2003 饲料中蛋氨酸羟基类似物的测定 高效液相色谱法 Determination of methionine hydroxy analogue in feeds- High-performance liquid chromatography 2007-06-21发布 2007-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 19371.2—2007 前言 本标准是GB/T19371.2一2003《饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定 高效液相色谱法》的修 订版。 本标准与GB/T19371.2—2003的主要差异如下： 对标准名称的修改，由“饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定”改为“饲料中蛋氨酸羟基类似物 的测定”。 对测定范围的修改，在范围中增加了预混料中羟基蛋氨酸钙的测定。 一对结果计算的修改，增加了羟基蛋氨酸钙的计算公式 将最低检出量规范为最低定量限。 本标准自实施之日起代替GB/T19371.2- 2003。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）。 本标准主要起草人：闫惠文、赵小阳、索德成、怀明燕。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T19371.2—2003。 GB/T19371.2—2007 饲料中蛋氨酸羟基类似物的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了高效液相色谱法（HPLC）测定配合饲料和浓缩饲料中液态蛋氨酸羟基类似物及配合 饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中羟基蛋氨酸钙的方法。 本标准适用于配合饲料和浓缩饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定，也适用于配合饲料、浓缩饲料 和添加剂预混合饲料中基蛋氨酸钙的测定。 本标准最低定量限为0.03%。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T19371.1—2003饲料添加剂 液态蛋氨酸羟基类似物 3原理 用10%的乙腈水溶液提取样品中的蛋氨酸羟基类似物，用氢氧化钾将蛋氨酸羟基类似物水解为有 活性的单体，磷酸调节水解液的pH值。反相高效液相色谱分离，紫外检测器214nm处测定蛋氨酸羟 基类似物含量。由蛋氨酸羟基类似物含量可以换算出羟基蛋氨酸钙的含量。 4试剂 以下所用的试剂，除特别注明外均为优级纯试剂，水符合GB/T6682一级用水的规定 4.1乙睛：色谱纯。 4.2提取剂：10%乙腈水溶液。 4.3氢氧化钾溶液：50%。 4.4不 磷酸溶液：1十1（体积比）。 4.5H HPLC流动相：5%乙腈水溶液，每升加入0.5mL三氟乙酸 4.6蛋氨酸羟基类似物标准样品：除非购买标样，否则需按GB/T19371.1一2003准确测定含量。 5仪器设备 5.1振荡器：水平方向振荡，频率250r/min~300r/min。 5.2超声水浴。 5.3HPLC系统，由下述部件组成。 5.3.1紫外检测器，适合在210nm处测定。 5.3.2分析柱：填有粒度为5um键合硅胶的Cls柱或性能相当的其他分析柱。柱温为室温。 1 GB/T19371.2—2007 6采样 6.1采样步骤 按GB/T14699.1采集实验室样品。 6.2试样的制备 将实验室样品粉碎，全部通过0.45mm筛，充分混匀，贮于磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取适量制备好的试料2g～5g（精确至0.0001g），置于150mL具塞三角瓶中，准确加入一定量 的提取液，一般50mL～100mL，混合后置于振荡器上剧烈振荡30min或置于超声水浴中提取30min， 静置10min，离心或过滤，滤液备用。 7.2水解 准确移取滤液5mL于10mL具塞试管中，准确加入0.1mL氢氧化钾溶液（4.3），手摇至少10s， 准确加人0.2mL磷酸溶液（4.4），手摇至少10s，水解液离心或过滤，滤液过0.45μum滤膜后备用。 7.3标准溶液的制备 准确称取0.1136g液态蛋氨酸羟基类似物（88.00%）标准样品，用提取剂（4.2)定容至100mL，蛋 氨酸羟基类似物浓度为1.00mg/mL。 准确吸取2.5、5.0、10.0、20.0mL以上溶液至50mL容量瓶，用提取剂（4.2）定容至刻度后摇匀， 此标准系列的浓度为0.05、0.10.0.20、0.40、1.00mg/mL。 用以上标准系列与试样提取液同时做水解，测定。 7.4HPLC测定 7.4.1色谱条件 流速：1.0mL/min。 检测波长：210nm。 进样量：20uL～50μL。 7.4.2测定 向HPLC分析仪连续注人蛋氨酸羟基类似物标准溶液，直至得到基线平稳、峰形对称且峰面积能 够重现的色谱峰。 依次注入标准及试样水解液，积分得到峰面积，用标准系列进行单点或多点校准。 8结果计算 试样中蛋氨酸羟基类似物的含量X，以质量分数（%）表示，按式（1)计算： CXV Xi = X 100 (1) mX1000 试样中羟基蛋氨酸钙的含量X，以质量分数（%）表示，按式（2)计算： cXV Xz = :(2 ) m×1 000300. 4 式中： c——由标准曲线查得的试样测定液中蛋氨酸羟基类似物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V——加到试样中的提取液体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g)； 338.4一一羟基蛋氨酸钙的分子质量； 2 GB/T19371.2—2007 300.4——羟基蛋氨酸的分子质量 平行测定结果用算术平均值表示，结果表示至小数点后两位 9 充许差 当含量小于0.5%时，两个平行试料测定值相差不大于0.05%；当含量大于或等于0.5%时，两个 平行试料测定值的相对偏差不大于5%