ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T192002003 猪水泡病诊断技术 Diagnostic techniques for swine vesicular disease 2003-06-17发布 2003-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T19200—2003 前言 猪水泡病（SwineVesicularDisease，简称SVD）是猪的一种烈性传染病，被世界动物卫生组织 [WorldOrganizationforAnimalHealth（英）,OfficeInternationaldesEpizooties（法），OIE］列为A类 疾病，我国将其列为一类动物疫病。本病主要在猪的蹄、蹄冠、唇、舌、鼻及乳头部引起水泡，临床症状 与猪口蹄疫（FootandMouthDisease，简称FMD)相似。 本标准提出的实验室方法主要是以世界动物卫生组织（OIE)《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病 诊断试验和疫苗标准手册》为依据，并结合我国实际情况制定，其中“猪水泡病反向间接血凝试验”是我 国建立的方法。 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为规范性附录。附录F为资料性附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州鲁医研究所。 本标准主要起草人：张永光、牟克斌、王永录、刘西兰、方玉珍 GB/T19200—2003 猪水泡病诊断技术 1范围 本标准规定了猪水泡病病毒分离及鉴定，反向间接血凝试验（RIHA）、琼脂凝胶免疫扩散试验 (AGID)和病毒中和试验（VN)的技术要求。 试验，包括产地检疫、疫情监测、流行病学调查和无本病健康猪群的建立；病毒中和试验（VN)适用于诊 断和进出口猪检疫及抗体水平的评估。 2病毒分离及鉴定 2.1材料准备 2.1.1灭菌注射器，研钵。 2.1.2pH7.6、0.05mol/L的磷酸缓冲液（PB)pH7.6、50%的丙三醇磷酸缓冲液（GPB),pH7.2、 0.11mol/L的磷酸缓冲液（PB)，配制方法见附录A。 2.1.3仔猪肾传代细胞（IB-RS-2），乳鼠。 2.1.4细胞培养液，见附录B。 2.2样品的采集及处理 2.2.1水泡液：将水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液，直接放入灭菌小瓶中，加盖封 口，避光送至实验室，不做处理直接用于检测。 2.2.2水泡皮：采集鼻镜、蹄部新鲜水泡皮，采集量为0.5g以上，放入预先加有pH7.6、50%的GPB 的灭菌瓶中，加盖封口，送至实验室。 2.3细胞分离 2.3.1新鲜水泡液不做任何处理，可直接使用。当IB-RS-2长满单层细胞后，弃去培养液，加入水泡 每天在倒置显微镜下观察2次，48h终判，若细胞培养液对照孔成立，分离病毒的细胞孔细胞出现变圆 乃至脱落，则视为细胞病变（CPE)判为阳性，若48h不出现CPE，则应冻融2次，再育传3代，不出现 CPE，判为阴性，出现CPE，则需做进一步鉴定。 2.3.2水泡皮的分离，将水泡皮用pH7.2、0.11mol/LPB洗2次～3次，用灭菌滤纸吸去水分，称其 质量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研钵中，按质量体积比（1：2）～（1：5）加入pH7.2、0.11mol/L PB研磨，制成悬液，室温浸毒1h或4℃12h，以3000r/min离心20min～30min，取上清液用于病毒 分离。 2.4乳鼠分离 2.4.1乳鼠为2～3日龄小鼠，每份材料接种4只小鼠，每只颈背部皮下接种0.1mL～0.2mL，在母 鼠哺乳下观察5天。 2.4.2若5天内出现神经症状乃至死亡，剥皮去头及内脏，将肌肉及骨胳一起称量，按质量体积比加 9倍的细胞培养液，加玻璃砂研磨制成悬液，置4℃浸毒过夜，以1000r/min离心10min，取上清液用 于进一步鉴定。 2.5反向间接血凝试验（RIHA)鉴定分离物 1 GB/T19200—2003 2.5.1材料准备 用滴管乳胶吸头或25uL、50uL移液加样器。 2.5.1.2稀释液I、稀释液Ⅱ，配制方法见附录C 2.5.1.3标准抗原、标准阳性血清。 2.5.1.4敏化红细胞诊断液，效价滴定见附录D 2.5.2操作方法 2.5.2.1使用标准抗原进行猪水泡病与口蹄疫A、O、C、Asia-I型鉴别诊断。 第一管加0.5mL被检样品，由左至右做二倍连续稀释（即1：6、1：12、1：24...·1：768），每管容积 0.5 mL. 2.5.2.1.2按下述滴加被检样品和对照： a）在血凝滴定板上的第一排至第五排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05mL，每排的 第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05mL，以此类推至第1孔； b）每排的第9孔滴加稀释液I0.05mL，作为稀释液对照； c）第一至第五排的第10孔按顺序分别滴加猪水泡病和口蹄疫A、O、C、Asia-I型标准抗原 （1：30稀释）各0.05mL，作为阳性对照。 10孔分别滴加猪水泡病和口蹄疫A、O、C、Asia-I型敏化红细胞诊断液，每孔0.025mL，置微量振荡器 上振荡1min~2min，20℃~35℃放置1.5h~2h后判定结果。 2.5.2.2使用标准阳性血清进行猪水泡病与口蹄疫O型鉴别诊断。 2.5.2.2.1在血凝滴定板上的第一排至第四排，每孔先各加入25μL稀释液Ⅱ。 2.5.2.2.2每排第1孔各加被检样品25L，然后分别由左至右做二倍连续稀释至第7孔（竖板）或第 11孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。 释至1：100的猪水泡病标准阳性血清；第四排每孔加人25uL稀释至1：20的口蹄疫0型标准阳性 血清；置微型混合器上振荡1min2min，加盖置37℃作用30min。 2.5.2.2.4滴加敏化红细胞诊断液：在第一排和第二排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液25μL； 第三和第四排每孔加入口蹄疫O型敏化红细胞诊断液25μL；置微型混合器上振荡1min2min，加盖 于20℃～35℃放置2h后判定结果。 2.5.3结果判定 围；“++十”为75%凝集，红细胞均匀地分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点； “十十”为50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“十”为25%凝集，孔 成一圆点。 2.5.3.2操作方法2.5.2.1的结果判定：稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集时试验方成立。 2.5.3.3若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病；若只第二排孔凝集，其余四 排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫A型；以此类推。 2.5.3.4致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。 2 GB/T19200—2003 2.5.3.5如出现2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为 底）浓度以上者即可判为阳性，其余判为阴性 2.5.3.6操作方法2.5.2.2的结果判定：稀释液IⅡ对照孔不凝集试验方可成立。 2.5.3.6.1若第一排出现2孔以上的凝集（“十十”以上），且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑 制，第三排、第四排不出现凝集，判为猪水泡病阳性。若第三排出现2孔以上的凝集（“十十”以上），且第 四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制，第一排、第二排不出现凝集则判为口蹄疫O型阳性。如水 泡病与口蹄疫均出现阳性反应，则判为同时感染水泡病与口蹄疫 2.5.3.6.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。 3琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID） 3.1材料准备 3.1.1平血（直径6.0cm）、打孔器、微量注射器或加样移液器、印相暗盒或台灯。 3.1.2琼扩精制抗原、标准阳性血清 3.1.3琼脂糖凝胶缓冲液（AGB)，饱和硫酸铵，pH7.2、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.2、 0.01mol/L的PBS)，配制方法见附录E。 3.1.4琼脂糖。 3.2操作方法 3.2.1琼脂糖平板制备 取琼脂糖1.0g加人99mLAGB,103kPa10min融化灭菌。吸取8mL琼脂液加到直径6cm的 平皿内，制成3mm厚的琼脂板。待琼脂冷却凝固后加盖置于湿盒中，放4℃冰箱备用。 3.2.2打孔 孔径、孔距均为3mm，按图1所示式样打孔。用针头将孔内的凝块挑出，并用烧热的大头针沿孔 底部周围划圈封底。 图1打孔式样 3.2.3被检血清样品的处理 3.2.3.1检疫用样品的处理：56℃水浴灭活30min。 3.2.3.2与口蹄疫鉴别及其分型诊断用样品的处理：吸取56℃水浴灭活30min的被检血清0.4mL， 加pH7.2、0.01mol/L的PBS0.4mL，混匀，逐滴加人饱和硫酸铵溶液0.2mL，摇匀，室温静置20 min8000r/min离心15min；取上清液逐滴加人饱和硫酸铵0.2mL，摇匀，室温静置20min，8000r/ min离心15min，沉淀物用0.2mL0.4mLpH7.2、0.01mol/L的PBS重新悬浮。此悬浮液供正式 试验用。 3.2.4加样 每4份被检样品取5块平皿，按图2所示方式加样。 3