ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23873—2009 饲料中马杜霉素铵的测定 Determination of maduramicin ammonium in feeds 2009-10-01实施 2009-05-26发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23873—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南） 本标准主要起草人：梁萌、汤文利、任爱丽、赵金毅、黄莹、李永山、刘学江。 GB/T23873—2009 饲料中马杜霉素铵的测定 1范围 本标准规定了测定饲料中马杜霉素铵含量的高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱法 (LC-MS)。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。HPLC法为定量测定方法，定量限为 1mg/kg。LC-MS法为定性测定方法，最低检测含量为0.5mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3采样 3.1采样步骤：按GB/T14699.1的规定执行。 3.2试样的制备：按GB/T20195的规定执行。 4HPLC法 4.1原理 用乙睛提取饲料中的马杜霉素铵，蒸干提取液用乙睛溶解，用对-二甲氨基苯甲醛溶液进行柱后衍 生，HPLC测定。 4.2试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.2.1水,GB/T6682，一级 4.2.2甲醇：色谱纯。 4.2.3乙腈：色谱纯。 4.2.4四氢呋喃：色谱纯。 4.2.5磷酸二氢钾：优级纯。 4.2.6 磷酸：优级纯。 4.2.7 对-二甲氨基苯甲醛：纯度99%。 硫酸：优级纯。 4.2.8 4.2. 9 ：磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液（pH3.0）：准确称取2.04g磷酸二氢钾（4.2.5），加900mL水溶解 加磷酸（4.2.6)数滴调节pH至3.0,转移到1000mL容量瓶中，用水定容、摇匀。 4.2.10 流动相：磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液（4.2.9）十四氢呋喃（4.2.4)十甲醇（4.2.2）=100十40十860。 4.2.11 对-二甲氨基苯甲醛衍生化溶液：准确称取16g对-二甲氨基苯甲醛（4.2.7）于1000mL棕色 试剂瓶中，加人400mL甲醇（4.2.2），在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，逐滴加入8mL硫酸 （4.2.8），继续搅拌至溶液均匀，冷却至室温，24h内使用。 1 GB/T23873—2009 4.2.12马杜霉素铵贮备溶液（1000ug/mL）：准确称取107.0mg（精确到0.1mg）马杜霉素铵化学对 照品（纯度93.7%）于100mL容量瓶中，用乙睛（4.2.3）溶解、定容，配制成浓度为1000μg/mL的贮 备溶液。置于4℃～8℃冰箱中，有效期为1个月。 50mL容量瓶中，用乙定容。置于4℃～8℃冰箱中，有效期为1周。 50mL容量瓶中，用乙睛定容。置于4℃～8℃冰箱中，有效期为1周。 4.2.15马杜霉素铵工作溶液：准确移取马杜霉素铵中间溶液IⅡ（4.2.14）1.00mL、5.00mL于10mL 容量瓶中，马杜霉素铵中间溶液I1.00mL、5.00mL于10mL容量瓶中，马杜霉素铵贮备溶液 1.00mL、2.00mL、3.00mL于10mL容量瓶中，用乙腈稀释、定容，配制成浓度分别为1.00μg/mL、 5.00μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL的工作溶液。现用现配。 4.3仪器 4.3.1实验室用样品粉碎机。 4.3.2分析天平：感量0.1mg。 4.3. 3 碘量瓶：150mL。 4.3.4 超声波清洗器。 4.3.5往复式振荡器。 4.3.6 带盖塑料离心管：100mL。 4.3.7离心机。 4.3.8 旋转蒸发仪：配置150mL鸡心瓶 4.3.9 旋涡混合器。 4.3.10高效液相色谱仪：具紫外检测器或二极管阵列检测器。 4.3.11柱后衍生系统。 4.4分析步骤 4.4.1提取 称取约5g试样（精确到0.1mg）于碘量瓶（4.3.3）中，加人乙50mL，置于超声波清洗器（4.3.4) 中超声15min，然后置于往复式振荡器（4.3.5）中快速振荡提取20min。转移到离心管（4.3.6）中，用 适量乙睛清洗碘量瓶三次，清洗液合并到离心管中。置离心机（4.3.7）4360g离心3min；上清液转移 到鸡心瓶（4.3.8）中，在旋转蒸发仪上60℃浓缩定容至5.00mL，旋涡（4.3.9）混匀，分取适量提取液过 有机滤膜上机测定。根据试料溶液中马杜霉素铵的浓度用乙睛进行稀释，使其上机浓度不高于 300 μg/mL。 4.4.2测定 4.4.2.1液相色谱测定参数的设定 色谱柱：Cls柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒度5μm或类似的分析柱。 柱温：25℃。 检测波长：585nm。 进样量：25μL。 流动相：磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液（pH3.0）十四氢呋喃十甲醇=100十40+860（4.2.10）。 流速：0.4mL/min。 4.4.2.2柱后衍生系统测定参数的设定 衍生化溶液：对-二甲氨基苯甲醛衍生化溶液（4.2.11）。 衍生化溶液流速：0.5mL/min。 反应器容积：1.00mL。 2 GB/T23873—2009 反应器温度：90℃。 4.4.2.3定量测定 在上述仪器条件下，分别注入马杜霉素铵工作溶液（4.2.15)和试料溶液（4.4.1)进行测定。用工作 溶液做单点校准或多点校准，以色谱峰的峰面积进行定量计算。 4.5结果计算 饲料中马杜霉素铵的含量X以质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)计算： X=AXV (1) m 式中： A———试料溶液中马杜霉素铵峰面积的响应值对应的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； V一试料溶液的体积，单位为毫升（mL）； m—试料的质量，单位为克（g）。 每个试样取两份试料进行平行测定，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，保留三位有效 数字。 4.6重复性 在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于10%。 5LC-MS法 5.1原理 用乙睛提取饲料中的马杜霉素铵，提取液蒸干后用乙睛溶解，用LC-MS测定。 5.2试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.2.1水,GB/T6682，—级。 5.2.2乙腈：色谱纯。 5.2.3流动相：乙睛（5.2.2）十水（5.2.1)=90十10。超声脱气5min。 5.2.4其他同4.2.12~4.2.15。 5.3仪器 5.3.1液相色谱-质谱仪。 5.3.2其他同4.3.1～4.3.9。 5.4分析步骤 5.4.1提取 同4.4.1，但需要根据试料溶液中马杜霉素铵的含量用乙睛进行稀释，使上机溶液浓度不高于 50 μg/mL. 5.4.2测定 5.4.2.1液相色谱测定参数的设定 色谱柱：Cs柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒度5μm或类似的分析柱。 进样量：5μL。 流速：0.2mL/min。 柱温：30℃。 流动相：乙腈十水=90十10（5.2.3）。 5.4.2.2质谱测定参数的设定 离子化模式：电喷雾离子源，负离子模式（ESI-）。雾化气压力：2.76×10Pa（40.0psi）。干燥气流 速：9.0L/min。干燥气温度：350℃。毛细管出口电压：一3500V。碰撞气：氨气。离子电荷控制 3