ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23874—2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 Determination of xylanase activity in feed additives- Spectrophotometric method 2009-10-01实施 2009-05-26发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23874—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准由中国农业大学农业部饲料工业中心、武汉新华扬生物有限公司、广东溢多利生物技术股份 有限公司负责起草。 本标准主要起草人：陆文清、曹云鹤、刘兴海、詹志春、刘亚力、陈清华。 GB/T23874—2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出量为10.0U/g。 SAC 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基 水杨酸（DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成 量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液 中木聚糖酶的活力。 在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原 糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 4试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。 4.1氢氧化钠溶液，浓度为200g/L 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。 4.2乙酸溶液，浓度为0.1mol/L 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 4.3乙酸钠溶液，浓度为0.1mol/L 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100mL。 4.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液，浓度为0.1mol/L，pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g，加人冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.50。 4.5木糖溶液（CH1o0s）,浓度为10.0mg/mL 称取无水木糖1.000g，加乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100mL 4.6木聚糖溶液，浓度为100mg/mL 称取木聚糖（SigmaX06271>）1.00g，加人0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢 1）SigmaX0627是商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品 能有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 GB/T23874—2009 加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，加人0.5mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测 定其pH。如果pH为5.50，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL。如果pH偏离5.50，再用乙 酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.50.然后再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL。使 用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为12h。 4.7DNS试剂 称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌3s～5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加人氢氧化钠过程中，溶液温度不要超 过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴 加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至 1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后方可使 用，有效期为180d。 5仪器与设备 5.1实验室用样品粉碎机或碾钵。 5.2分样筛：孔径为0.25mm。 5.3分析天平：感量0.001g。 5.4pH计：精确至0.01。 5.5石 磁力搅拌器：附加热功能。 5.6电磁振荡器。 5.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。 5.8 离心机：最大离心加速度不小于2000g。 5.9恒温水浴锅：温度控制范围在30℃～60℃之间，精度为0.1℃。 5.10 秒表：每小时误差不超过5s。 5.11 可见分光光度计。 5.12移液器：精度为1μL。 6绘制标准曲线 6.1吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4)4.0mL，加人DNS试剂（4.7)5.0mL，沸水浴加热5min。用自 来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。 6.2分别吸取木糖溶液（4.5)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL， 分别用缓冲溶液（4.4）定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、 0.40mg/mL.0.50mg/mL.0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。 别加入2.0mL缓冲液（4.4）和5.0mLDNS试剂（4.7）。电磁振荡3s~5s，沸水浴加热5min。然后 用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度 A值。 以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制 标准曲线。 7反应用酶液的制备 7.1固体样品的反应用酶液制备 按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g。加入40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液 2 GB/T23874—2009 （4.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（4.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h～2h。上离 心机（5.8)1000g离心3min～5min，取上清液，再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中 木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL～0.10U/mL之间）。 7.2液体样品的反应用酶液制备 液体样品可以直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4)进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖酶活力最 （4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节校正至5.50，然后再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释定容。 8测定步骤 吸取10.0mL木聚糖溶液（4.6）,37℃平衡20min。 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（7.1或7.2），37℃平衡10min。 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加人到刻度试管中，再加人5mLDNS试 剂（4.7），电磁振荡3s~5s。然后加人2.0mL木聚糖溶液（4.6），37℃保温30min，沸水浴加热 5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s～5s。以标准空白样（6.1)为空白对照， 在540nm处测定吸光度A。 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加人到刻度试管中，再加人2.0mL木聚 糖（4.6)（已经过37℃平衡），电磁振荡3s~5s，37℃精确保温30min。加人5.0mLDNS试剂（4.7）， 电磁振荡3s~5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电 磁振荡3s～5s。以标准空白样（6.1)为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。 9试样酶活力的计算 用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式（1)和式（2)计算： (1) MXt 式中： Xp一一稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL； Ae 酶反应液的吸光度； A酉 酶空白样的吸光度； K- 标准曲线的斜率； Co— 标准曲线的截距； M—木糖的摩尔质量，M(CsHioO.）=150.2g/mol; 酶解反应时间，min； t 1000—转化因子，1mmol=1000μmol。 Xp值应在0.04U/mL～0.10U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再 进行分析测定。 X =XXD ..(2 ) 式中： X一试样中木聚糖酶的活力,U/g(或 U/mL); D—试样的稀释倍数。 3