ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22332—2008 鸭病毒性肠炎诊断技术 Diagnostic techniques for duck virus enteritis 2008-08-22发布 2008-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22332—2008 前言 本标准部分技术采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2004）推荐的试验方法，并把具体操作 程序予以细化。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：华南农业大学、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：郭雪峰、廖明、洪洁心。 GB/T22332—2008 鸭病毒性肠炎诊断技术 1范围 本标准规定了鸭病毒性肠炎病毒（DVEV)分离和鉴定及聚合酶链式反应（PCR）试验的诊断技术 要求。 本标准适用于鸭病毒性肠炎的诊断。 2临床症状和病理变化 家养的鸭和维鸭从7日龄至成年均可感染发病。在易感鸭群，初始症状通常为突发持续性高死亡 现象，产蛋量明显下降。由于感染禽的品种、年龄、性别以及病毒毒力的不同，暴发鸭病毒性肠炎 （DVE）后临床症状、剖检病变有很大的差异。种鸭临床症状为流泪、怕光、烦渴、缺之食欲、共济失调、 水样腹泻和流鼻液。通常病鸭羽毛蓬乱，肛门粘有污物。病鸭借助翅膀支撑方能保持平衡，整个外观虚 弱、精神沉郁。但2周～7周龄鸭中损失比成鸭低，其症状为脱水、体重下降，喙呈蓝色，肛门染有血迹。 剖检时发现，死亡的鸭并不消瘦。性成熟的公鸭的阴茎可能脱垂。性成熟母禽的卵巢滤泡出血。 特征性大体病变以血管受损，带有组织出血和体腔游离血液，消化道粘膜表面有环状出血和白喉样损 坏，淋巴样器官受损，实质器官呈退行性病变为特征。白色北京鸭的特征性病变是血管及内脏器官损 伤，消化道上皮细胞出现嗜酸性核内包涵体和胞浆内包涵体。 3病毒分离 3.1材料准备 3.1.1病料的采集：一般应在感染初期或发病急性期从濒死期禽或活禽采取。濒死期禽采集肝、脾、脑 等组织样品。活禽用灭菌的棉拭子涂抹泄殖腔。带有分泌物的棉拭子放人每毫升含有1000IU青霉 素,1000μg链霉素，pH7.2～7.6的磷酸盐缓冲液（PBS)中。送检病料应置于50%的甘油生理盐 水中。 3.1.2病料的保存：采集的样品若在48h内处理，可于4℃保存；否则应放一20℃以下保存（一70℃ 贮存最好）。 3.1.3病料的处理：将棉子充分捻动、拧干后除去拭子。样品液经3000r/min4℃离心30min，取 上清液作为接种材料。组织样品先用pH7.2～7.6的PBS制成5倍～10倍乳剂，3000r/min4℃离心 30min，取上清液作为接种材料。为防止细菌污染，可在样品液中加入青霉素（1000IU/mL），链霉素 3.1.4鸭胚：10日～11日龄的非DVE疫苗免疫鸭胚。 3.2实验操作 3.2.1胚胎接种：取经处理并且无菌检验合格的样品，以0.2mL/胚的量经绒毛尿囊膜接种10日～ 11日龄的非DVE疫苗免疫的鸭胚，每个样品接种4个～5个胚，于38℃～38.5℃恒温箱中孵育。 或活胚。 3.2.3如第一代分离结果为阴性，需盲传三代。 1 GB/T22332—2008 4PCR 4.1引物 P:GAGCGT ATTTAGTAGAAACTGC(上游) P2:TGA ATG TTG TGA TTG TTC(下游) 4.2病毒核酸的抽提 4.2.1组织样品用pH7.2~7.6的PBS制成5倍~10倍乳剂，3000r/min4℃离心30min，上清液作 为待检材料。 4.2.2取一支1.5mL的指形管，加人400μL待检胚液或4.2.1上清液和30μL(20mg/mL）核糖核 酸，混匀后，室温下作用20min 4.2.3加43uL10%的十二烷基磺酸钠溶液和5uL（10mg/mL）蛋白酶K，42℃水浴温育过夜 另一个指形管中。 4.2.5加等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸出上层 水相于另一个指形管中。 4.2.6加1/10体积3mol/L的乙酸钠（pH5.4），2.5倍体积预冷的无水乙醇，15000r/min离心 20min，弃去乙醇，沉淀用75%的乙醇洗涤一次，真空干燥。用20uL灭菌双蒸水溶解沉淀，一20℃保 存备用。 4.3操作程序 取一支0.5mL的指形管，依次加人下列试剂：2.5μL10×的PCR缓冲液，1.0μL上游引物， 1.0μL下游引物，0.5uLdNTP，1.0μL病毒核酸18.5uL灭菌双蒸水.0.5μLTaqDNA酶。于PCR 仪中运行：94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环，72℃8min。同时设立阳性和阴性对照。 4.4PCR产物的检测 反应结束后，PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，每个样品的加样量为5μL～10μL，同时以 100bpDNA分子质量标准物为参照。50V恒压电泳40min，于紫外灯下观察。 4.5结果的判定 阳性对照在416bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照没有目的带，证明本实验成立。待检样品 在相同位置有DNA带，判为阳性，否则为阴性。 2 GB/T22332—2008 4PCR 4.1引物 P:GAGCGT ATTTAGTAGAAACTGC(上游) P2:TGA ATG TTG TGA TTG TTC(下游) 4.2病毒核酸的抽提 4.2.1组织样品用pH7.2~7.6的PBS制成5倍~10倍乳剂，3000r/min4℃离心30min，上清液作 为待检材料。 4.2.2取一支1.5mL的指形管，加人400μL待检胚液或4.2.1上清液和30μL(20mg/mL）核糖核 酸，混匀后，室温下作用20min 4.2.3加43uL10%的十二烷基磺酸钠溶液和5uL（10mg/mL）蛋白酶K，42℃水浴温育过夜 另一个指形管中。 4.2.5加等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸出上层 水相于另一个指形管中。 4.2.6加1/10体积3mol/L的乙酸钠（pH5.4），2.5倍体积预冷的无水乙醇，15000r/min离心 20min，弃去乙醇，沉淀用75%的乙醇洗涤一次，真空干燥。用20uL灭菌双蒸水溶解沉淀，一20℃保 存备用。 4.3操作程序 取一支0.5mL的指形管，依次加人下列试剂：2.5μL10×的PCR缓冲液，1.0μL上游引物， 1.0μL下游引物，0.5uLdNTP，1.0μL病毒核酸18.5uL灭菌双蒸水.0.5μLTaqDNA酶。于PCR 仪中运行：94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环，72℃8min。同时设立阳性和阴性对照。 4.4PCR产物的检测 反应结束后，PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，每个样品的加样量为5μL～10μL，同时以 100bpDNA分子质量标准物为参照。50V恒压电泳40min，于紫外灯下观察。 4.5结果的判定 阳性对照在416bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照没有目的带，证明本实验成立。待检样品 在相同位置有DNA带，判为阳性，否则为阴性。 2