ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.12004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR 检 测 方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19438.1—2004 前言 GB/I19438—2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： GB/T19438.1—2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.2—2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； —GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.4—2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A、附录C是规范性附录，附录B是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人：赖平安、张鹤晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少梅 GB/T19438.1—2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测 方法 1范围 本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。 2缩略语 SAG 下列缩略语适用于本部分。 2. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2. 4 DEPC 焦碳酸乙二酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A)。 2. 6 Taq 酶 Taq DNA聚合酶。 3原理 禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性 引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位 于引物结合区域内。探针的5端和3端分别标记不同的荧光素，如5°端标记FAM荧光素，它发出的荧 光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内 能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。 当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发 出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时， Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸 进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5→3外切核酸酶的功 能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再 GB/T19438.1—2004 不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游 离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。 4材料与试剂 4.1仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪。 4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。 4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min）。 4.1.4混匀器。 4.1.5冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）。 4.1.6微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头。 4.1.7 Eppendorf 管(1.5 mL)。 4.2试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水 处理后高压灭菌)分装。 4.2.1三氯甲烷。 4.2.2异丙醇：一20℃预冷。 4.2.3PBS：121℃土2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL。 4.2.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷 4.2.5禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒1：组成、功能及使用注意事项参见附录B。 5抽样 5.1采样工具 下列采样工具必须经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干： 棉拭子； 一剪刀、镊子； —注射器； —1.5mLEppendorf管； 一研钵。 5.2样品采集 5.2.1活禽 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 一取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液； 一取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； 一将拭子一并放人盛有1.0mLPBS的1.5mLEppendorf管中，加盖、编号。 5.2.2肌肉或组织脏器 待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。 5.2. 3血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.3样品购运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T19438.1—2004 实验室。 5.4样品制备 5.4.1咽喉、泄殖腔拭子 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转 入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用 5.4.2肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃、3000r/min离 心15min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5.5样本存放 制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复 冻融（冻融不超过三次）。 6操作方法 6.1实验室标准化设置与管理 禽流感病毒通用荧光RT一PCR检测的实验室规范（见附录C）。 6.2样本的处理 在样本制备区进行。 6.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、 阴性对照在试剂盒中已标出），编号。 6.2.2每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200uL，一份样本换用一 个吸头，再加人200μL三氯甲烷，混勾器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手 颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。 6.2.3取与6.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），做标记。 吸取本标准6.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L，不能吸出中间层，颠 倒混匀。 6.2.4于4C、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上 清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）；加人600μL75%乙醇，颠倒 洗涤。 6.2.5于4℃、12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上 清液，倒置于吸水纸上，尽量活干液体（不同样品须在吸水纸不同地方活干）。 6.2.64000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩 到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一 面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。 6.2.7加人11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提 取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置一70℃C冰箱。 6.3检测 6.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设 所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体 系配制见表1。