ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31809—2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pythium splendens Braun 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31809—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张慧丽、张建成、顾建锋、郑炜、徐瑛、陈先锋、段维军、陈吴健、吴志毅、杜洪忠、 吴品珊 I GB/T31809—2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法 1范围 2仪器设备 生物显微镜（具油镜镜头）、具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于50X）、高压灭菌锅、天 平（感量1/100g，1/10000g）、研钵、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、分光光度计、高速冷冻 离心机、真空抽干仪、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、普通PCR仪、光学PCR反应管、pH计、电 泳仪、水平电泳槽、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、 1000μL）、PCR反应管（0.2mL、0.5mL）、锥形瓶、试管、培养皿、载玻片、盖玻片。 3主要试剂和培养基 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钾、 无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、氨芋青霉素、利福平、制霉菌素、苯菌灵、氯化钠、 CTAB、TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、10XPCR缓冲液、琼脂糖、DNA分子量标准、Tris/EDTA/ SDS提取缓冲液（TES）、Tris/EDTA缓冲液（TE）、Tris硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）等。培养基及缓 冲液配制方法见附录B。 4检疫鉴定 SAC 4.1症状检查 仔细检查根部，根部症状是软化变褐，腐烂；茎部症状是出现灰色或棕黑色水渍状斑点（参见 附录A）。对可疑植物和繁殖材料的介质王应取样做进一步检验。 4.2 组织分离 选萎為及根部变褐但没有完全腐烂的植物材料，用流动的自来水冲洗干净，在根茎病健交界处切取 0.5cm×0.5cm的小块组织，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干表面 水分后，置于选择性培养基上，25℃～30℃黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌丝尖端转移到 基础培养基上纯化，保存备用。 4.3土壤诱集 对禾本科植物叶片（如：马唐、狗尾草、稗草等）进行高温高压灭菌处理，剪成直径1cm大小的小片 作为诱饵。取5g～20g土壤样品研磨破碎放人50mL灭菌洁净烧杯中，厚度不超过2cm，缓慢加人无 菌水没过土表1cm～2cm，用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣，每烧杯水面放置诱 饵10片左右。静置过夜，体式显微镜下观察，将有菌丝体长出的诱饵取出，用无菌水洗净表面，无菌吸 1 GB/T31809—2015 水纸吸干，放人选择性培养基平板上培养。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核，挑取 菌丝尖端转移到基础培养基上纯化，保存备用。 4.4培养物观察 得到病菌纯培养物后，挑出菌丝制片。用解剖针将菌丝尽量展开，观察病菌特征。需测量不少于 30个菌丝膨大体大小，计算平均值。 4.5 5PCR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录C。 5鉴定特征 5.1 培养性状 在基础培养基上菌落边缘整齐，气生菌丝发达，蛛丝状。 5.2形态特征 5.2.1菌丝和菌丝体 菌丝不规则分枝，菌丝宽3.5μm～9.2um，平均6.4um。培养基上菌丝膨大体丰富，叶片诱集可产 生大量菌丝膨大体。菌丝膨大体（参见附录A）球形至近球形，光滑，通常顶生，很少间生，直径25μm～ 49μm，在异宗配合腐霉中油棕猝倒病菌的菌丝膨大体直径最大，平均38μm，其余种菌丝膨大体平均 直径小于30m，菌丝膨大体内充满颗粒状原生质，菌丝膨大体需在有水的情况下经数小时萌发，萌发 时每个膨大体产生1个～6个芽管，不产生游动孢子囊和游动孢子。 5.2.2有性生殖阶段特征 有性繁殖为异宗配合，但有些分离物单培养也可以形成藏卵器，藏卵器也可以出现在老化的培养物 或培养数年的菌株上。藏卵器顶生或间生，球形，器壁光滑、薄，直径24μm～38μm。雄器异丝生，顶 生，偶尔间生，每个藏卵器1个～8个雄器，柄有时分支或分叉，多个雄器同时围绕一个藏卵器，雄器细 胞大，通常20μm×15μm，直或颈状弯曲。卵孢子游离在藏卵器内，不满器，与藏卵器的比例为1：1.2， 直径20μm~33μm，壁光滑，薄，壁厚1μm～2μm（参见附录A）。 6结果判定 以油棕猝倒病菌在寄主上的症状、分离物的培养特征、无性及有性世代阶段特征等作为鉴定依据， 进行综合判定。若以上特征与第5章鉴定特征吻合，则鉴定为油棕猝倒病菌。若菌丝膨大体平均值小 于38um，应进行分子鉴定，分子鉴定结果为阳性，可判定为油棕猝倒病菌 7样品保存与结果记录 7.1样品保存 经检验确定携带油棕猝倒病菌的样品，经登记和标记后视样品的状态采用相应的保存方式，要善保 存6个月，以备复核。保存期满后，应经灭菌处理。 GB/T 31809—2015 7.2 2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为油棕猝倒病菌的菌株，应妥善保存。对不需要长期保存的菌株应及时 高压灭菌处理。 7.3 结果记录与资料保存 需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、被为害状及为害程度（无症状也要说明），诊断 时使用的方法，PCR检测应有电泳结果照片，鉴定实验室的名称，负责人和鉴定人的签字等。 3