ICS 07.060 A45 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 30744—2014 深海微生物样品前处理技术规范 The technology specification for the pre-treatment of deep-sea microorganism samples 2014-06-09发布 2014-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30744—2014 目 次 前言 范围 1 规范性引用文件 2 术语、定义和缩略语· 3 试剂和材料 仪器与设备 般规定 样品现场处理 深海微生物菌种分离 8 深海微生物基因组DNA提取 9 10 10 深海微生物宏基因组DNA提取 12 深海生物样品及微生物资源保存 11 13 附录A（资料性附录） 深海微生物样品前处理记录表格式 22 附录B（资料性附录） 耐压菌株分离 28 附录C（资料性附录） 微生物菌种分子鉴定…· 29 附录D（资料性附录） 宏基因组 Cosmid文库构建 32 表 A.1 深海样品采样记录表 22 表 A.2 深海微生物分离鉴定记录表 22 表A,3 深海微生物基因组DNA提取记录表 23 表 A.4 深海样品宏基因组DNA提取记录表 23 表A.5 深海样品保藏记录表 24 表A.6 深海细菌保藏记录表 24 表 A.7 深海放线菌保藏记录表 25 表A.8 深海真菌保藏记录表 表A.9 深海样品宏基因组DNA文库记录表 27 表 C.1 16SrRNA基因通用引物的适用范围 GB/T30744—2014 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由国家海洋局提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。 本标准起草单位：国家海洋局第三海洋研究所。 本标准主要起草人：曾润颖、邵宗泽、叶德赞、陈新华、林荣澄、孙凤芹、徐丽美、盖英宝。 I GB/T30744—2014 深海微生物样品前处理技术规范 1范围 本标准规定了深海微生物样品前处理中的技术要求、工作条件、深海样品现场处理、微生物及遗传 物质提取、保存及资料处理。 本标准适用于水深大于或等于1000m的深海微生物样品的现场处理、提取与保存。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T12763.4海洋调查规范第4部分：海洋化学要素调查 GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查 HY/T058海洋调查观测监测档案业务规范 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 3.1术语和定义 3.1.1 深海deep sea 水深大于或等于1000m的海洋区域。 3.1.2 微生物样品 microorganism samples 已培养或已提取纯化的，具有一定科学意义，具有实际或潜在实用价值的，可直接应用于各种科学 研究的各种菌株（包括细菌、真菌、放线菌等）、DNA/RNA等遗传物质；以及包含上述菌株和遗传物质 的深海样品，包括水样、沉积物样、岩石样等。 3.1.3 前处理pre-treatment 在开展深海微生物研究工作之前对采集自深海的各种微生物样品（见3.1.2)所进行的各种处理，包 括：深海生物样品现场处理、深海微生物菌种分离、深海微生物基因组DNA提取、深海微生物宏基因组 DNA提取、深海生物样品及微生物资源保藏。 3.1.4 低温微生物 cold-adaptedmicroorganism 在37℃以下的温度中生长良好的微生物（包括细菌、真菌、放线菌等），最适生长温度等于或低于 25℃。 3.1.5 嗜热微生物thermophile 在等于或高于55℃的温度中生长良好的微生物（包括细菌、真菌、放线菌等）。 1 GB/T30744—2014 3.1.6 宏基因组 metagenome 不经菌株分离筛选步骤，直接从环境样品中提取的遗传物质（DNA或RNA），包含了样品中所有微 生物的基因信息。 3.1.7 寡营养培养基 oligotraphicmedium 与正常培养基成分相同，但碳源、氮源营养物质浓度减为十分之一的培养基。 3.2 缩略语 16SrRNA：细菌染色体上编码核糖体RNA16S亚基的基因 18SrRNA：真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因 Amp：氨青霉素（Ampicillin） BOD：生化需氧量（Biochemicaloxygendemand) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltriethylammnoniumbromide） dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosinetriphosphate） DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) DMF：二甲基酰胺（N,N-Dimethylformamide) EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid) GYT：甘油酵母膏蛋白陈培养基（Glycerolyeastextracttryptonemedium） IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside） LB：肉汤培养基（Luria-bertani) OD：光密度（Opticaldensity) PFGE：脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgelelectrophoresis) PDA：马铃薯葡萄糖培养基（Potatodextroseagar) RNase A：核糖核酸酶A(RNAaseA) SDS：十二烷基硫酸钠（Dodecylsulfate，sodiumsalt） SOC：含分解代谢抑制物的超级肉汤培养基（Superoptimalbrothwithcataboliterepression） Tris：三羟甲基氨基甲烷（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) TE：Tris-HCI和EDTA-Na2配成的缓冲液 TBE：Tris-HCI、硼酸和EDTA-Na配成的缓冲液 X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside) YPD：酵母膏蛋白陈葡萄糖培养基（Yeastextractpeptonedextrosemedium） 入DNA/EcoRI+HindⅢ：经EcoRI酶（4.1)和HindⅢ酶（4.2)两种核酸内切酶消化后的入噬 菌体DNA 4试剂和材料* 4.11 EcoR I酶。 4.2 Hind Il酶。 SV 4.3 BamH I酶。 除非另有说明，在操作中仅使用分析纯试剂和电阻率大于18MQ·cm的超纯水。 2