ICS 65.020.30 B 40 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T24863—2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 Technical regulation of farm animals cell culture and cryopreservation 2010-06-30发布 2011-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T24863—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人：关伟军、马月辉、李向臣、李晗、闫雷、赵倩君、宫雪莲 GB/T24863—2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 1范围 本标准规定了畜禽体细胞保存方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽细胞体外培养与保存 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 体细胞体外培养 invitrosomaticcellculture 将体细胞在模拟体内生存环境的体外条件中进行培养，使细胞生长增殖，并保留其完整结构和功能 特性的方法。 3.2 原代细胞培养primarycellculture 将体细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法。 3.3 细胞冷冻保存 cellcryopreservation 将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，使其于液氮中长期保存的 过程。 4工作区条件 工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。 其中，缓冲间面积应不小于3m²，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m3。紫 外线灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达 到万级。 5主要仪器、设备 超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平、CO2培养箱、 超纯水装置和显微镜等。 6清洗与消毒 6.1玻璃器血清洗与消毒 6.1.1浸泡 所需的玻璃器血在含有洗涤剂的清水中浸泡12h。 1 GB/T24863—2010 6.1.2刷洗 选软毛毛刷，反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60℃下烘干后备用 6.1.3酸浸 酸浸时间为24 h。 6.1.4冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用超纯水浸洗3次～5次，烘干包装。 6.1.5消毒 高压灭菌应以0.14MPa～0.16MPa的压力下持续15min~30min。 6.1.6初次玻璃器血使用 初次使用玻璃器血需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，其余操作同 6.1.3、6.1.4和6.1.5等步骤。 6.2金属器血清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外，其余步骤同6.1。 6.3塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器血清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡 12h，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干 后备用。高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min。 7试剂与培养液 7.1 水 实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。 7.2平衡盐溶液 生理盐水或磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）适用于细胞传代前漂洗细胞。 7.2. 1 PBS 称取4.00gNaCl、0.10gKCl、1.45gNa2HPO4·12H,O、0.10gKH,PO4，加超纯水定容至 500mL，调节pH至7.2，高压灭菌，密封后置于4℃条件下贮存。 7.2.2生理盐水 称取4.50gNaCl.加入500mL超纯水，高压灭菌，密封后置于4℃条件下贮存。 7.3血清 10%~15%的胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）适合于家畜和家禽细胞的培养。 7.4培养基 85%～90%的高糖最低限量必需培养基（minimumessentialmedium，MEM），适用于家禽细胞的 培养85%～90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（dulbecco'smodifiedeaglemedium，DMEM)，适 用于家畜细胞的培养。用直径为0.22μm和0.45um滤器过滤。 7.4.1MEM（含Earles盐）培养基 称取9.60gMEM,溶于1000mL超纯水中，加入2.20gNaHCO3，使最终pH为7.2~7.4用 0.22μm的滤器进行过滤、分装。从每瓶中取3mL～5mL用于检菌，其余置于4℃条件下贮存。 7.4.2高糖DMEM培养基 称取13.40gDMEM,溶于1000mL超纯水中，加入3.70gNaHCO，使最终pH为7.27.4，用 0.22μm的滤器进行过滤、分装。从每瓶中取3mL～5mL用于检菌，其余置于4℃条件下贮存。 7.4.3全培养基 培养基检菌3d后，取出未被污染的MEM或DMEM培养基加人特级FBS，使其终浓度为10%。 用0.22μm的滤器过滤、分装。从每瓶中取3mL5mL用于检菌，其余置于4℃条件下贮存。 2 GB/T24863—2010 7.5消化液 称取0.10g（用于家禽）或0.25g（用于家备）胰蛋白酶干粉，溶于PBS中，调pH至7.2~7.4，定容 至100mL。无菌操作台内，0.22μm滤器过滤除菌、分装，密封后一20℃条件下贮存。 7.6冻存液 MEM或DMEM的基础培养基加入终浓度为1o%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）和 20%~50%FBS.0.22μm滤膜过滤除菌，密封分装，置于一20℃条件下贮存。 8体细胞体外培养与保存 8.1样品采集 8.1.1家畜样品采集 采集家畜耳缘组织、脏器。耳缘组织采集需先用75%的酒精对采样部位进行消毒，剪净耳毛后再 进行消毒采样；采集脏器样品时要用生理盐水冲洗干净。根据实验需要选取大小适中的组织样品，放入 5mL备有PBS或相应基础培养基的离心管中，封口后立即标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样 部位、个体编号和采样时间等信息，并在记录本上记录。 8.1.2家禽样品采集 8.2样品运输 样品放入4C的采样箱后应迅速运往实验室。保存在PBS中的样品应在24h内进入原代培养阶 段。保存在基础培养基中的样品应在48h内带回实验室进行原代培养。 8.3原代细胞培养 8.3.1家畜细胞原代培养 后加入适量全培养基浸润组织样品，直至组织样品贴壁牢固时翻瓶加液进行原代培养。 8.3.2家禽细胞原代培养 家禽的胚胎需要去掉脑、眼、四肢和内脏，其余步骤同8.3.1。 8.4传代培养 8.4.1家畜细胞传代培养 当家畜细胞汇合达到培养瓶底壁的80%～85%时，弃去培养基，用生理盐水或PBS清洗3次，加人 适量的0.25%的胰蛋白酶到培养瓶顶壁，37℃、5%CO2培养箱中放置5min，翻瓶，再置于培养箱中作 用30s，倒置显微镜下观察到细胞质回缩，细胞间隙增大时，拍打培养瓶使细胞分散。然后立即加入全 培养基，分瓶培养。 8.4.2家禽细胞传代培养 培养家禽细胞时，加人适量的0.10%胰蛋白酶，立即翻瓶，其余步骤同8.4.1。 8.5细胞冷冻保存 传3代后，细胞汇合达到培养瓶底壁的80%～85%，按常规法消化细胞，加人全培养基，制成均匀 的单细胞悬液，计算细胞总数。300g离心8min，弃上清，根据细胞总数加入适量冻存液混匀，使细胞密 度达到1.0X10°个/mL~3.0X10%个/mL，按每管1mL分装于冻存管中，标明细胞名称、冻存管编 号、性别和冻存日期。将冻存管放入程序降温盒中置于一70℃条件下5h～6h或将冻存管放人程序降 温仪5h6h降温至一70℃后，立即转人液氮中长期保存。