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SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4613—2016 国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR method for Kunjin virus detection at frontier ports 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4613—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。 本标准主要起草人:孙肖红、刘键、闫冀焕、徐宝梁、马雪征、张丽萍、白红岩 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4613—2016 国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了昆津病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存,标本的处理和荧光RT PCR检测。 本标准适用于昆津病毒的荧光RT-PCR检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录(中华人民共和国卫生部 卫科教发[2006】15号) 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件, 3.1 昆津病毒Kunjinvirus;KUNV 也可译为“库京病毒”,属于黄病毒科黄病毒属成员,于1960年在澳大利亚的环喙库蚊(Culexan nulirostris)中首次分离。除了环喙库蚊以外,伪杂鳞库蚊(Culerpseudovishnui)、致倦库蚊(Culer quinquefasciatus)、澳大利亚库蚊(Culeraustralicus)和鳞状库蚊(Culersuamosus)等也可传播该病 毒。病毒的主要宿主是鸟类、家禽、猪、牛、马。水鸟可以将病毒传播至远方,而猪、牛、马又可起到放大 宿主的作用。昆津病毒病是一种人畜共患病,主要流行于澳大利亚,人类感染后主要表现为发热、头痛、 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 FAM FAM荧光染料,一种荧光报告基团; RNA 核糖核酸; RT-PCR 反转录-聚合酶链反应。 生物安全要求 C 《人间传染的病原微生物名录》规定,昆津病毒的未经培养的感染性物质、灭活材料的操作应在不同 级别生物安全实验室进行,具体如下: 1 SN/T 4613—2016 昆津病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2或ABSL-2)实验室内进行; 昆津病毒相关的灭活材料在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行; 昆津病毒感染性材料运输包装分类为B类,UN编号为UN3373。 6标本的采集、运输和保存 6.1人血清标本 无菌采集可疑病人的静脉血3mL~5mL,室温静置30min,然后500g离心10min,收集上清(血 清)于2mL螺口塑料管内,用耐低温油性记号笔记上编号,4℃以下送检。不能及时检测的标本应保存 于一70℃或以下温度。 6.2蚊虫 根据实际工作需要采集蚊虫样品。将采集的蚊虫直接放人一20℃冰箱冻死后,取出,分类编号,按 30只~50只一份,装入2mL螺口塑料管内,用耐低温油性记号笔记上编号,干冰或液氮运输,或 一70℃以下保存待检。 7标本的处理 7.1 人血清标本 血清标本可直接提取核酸。 7.2蚊虫 7.2.1从一70℃容器中取出蚊虫标本,倒人研磨器中。 7.2.2加人1mLPBS或生理盐水吹洗,弃去液体后加人1mLPBS或生理盐水,反复研磨至组织碎片 基本消失。 7.2.3将研磨液吸人1.5mL离心管,配平后置预冷4℃的离心机上,20000g离心10min 标准信息服务平台 7.2.4取上清液提取核酸。 8荧光RT-PCR检测 8.1主要仪器 需要以下仪器: 荧光定量PCR仪; 超净工作台; 生物安全柜; 高压灭菌锅; 低温高速离心机:最大离心力20000g; 漩涡振荡器; 冰箱:4℃、-20℃和-70℃; 移液器:10μL、20μL、100μL、200μL和1mL。 2
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