ICS 65.020.20 B 21 备案号：33041-2012 湖 北 DB42 省 地 方 标 准 DB42/T 800—2012 两系杂交水稻 品种纯度 SSR 检测方法 Procedure for testing seed purity of two-line system hybrid rice by SSR 2012 - 01 - 12 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 05 - 04 实施 发 布 DB42/T 800-2012 目 次 前言..................................................................................................................................................................... Ⅱ 1 2 3 4 5 6 7 范围................................................................................................................................................................. 1 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 术语和定义..................................................................................................................................................... 1 原理................................................................................................................................................................. 2 核心引物确定原则......................................................................................................................................... 2 检测程序......................................................................................................................................................... 2 结果计算......................................................................................................................................................... 3 附录 A （资料性附录） NY/T1433-2007 推荐的 24 对 SSR 引物序列.......................................................... 4 附录 B （资料性附录） 47 对湖北省现有两系杂交水稻品种纯度 SSR 检测常用引物序列...................... 5 附录 C （规范性附录） 相关试剂配制...........................................................................................................7 I DB42/T 800-2012 前  言 本标准按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖北省农业厅提出并归口。 本标准起草单位： 湖北省种子管理局。 本标准主要起草人：周正明、谢建平、李彧、高明鑫、马磊。 II DB42/T 800—2012 两系杂交水稻 品种纯度 SSR 检测方法 1 范围 本标准规定了两系杂交水稻 品种纯度SSR检测技术方法的术语和定义、原理、核心引物确定原则、 检测程序和结果计算。 本标准适用于品种真实性已经确认的两系杂交水稻 品种纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.4-1995 农作物种子检验规程 发芽试验 NY/T 1433-2007 水稻品种鉴定DNA指纹方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 简单重复序列 SSR simple sequence repeats 又称微卫星序列或串联重复序列，是由1-5个核苷酸为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp 的串联重复序列。 3.2 聚合酶链式反应 PCR polymerase chain reaction 一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板DNA经高温变性分解为两条单链，在适宜温度下，经 DNA聚合酶的催化作用，两条引物分别与DNA模板两条单链上的一段互补序列发生退火结合，然后在DNA 聚合酶的催化下以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP deoxyribonucleoside triphosphate）为底物，引物延 伸合成DNA。如此变性分解、退火结合和延伸合成DNA反复循环，使位于引物序列之间的DNA片段呈几何 倍数扩增。 3.3 引物 primer 具有游离的3’-OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合后启动PCR反应。 3.4 亲本种子 parental 1 DB42/T 800-2012 用于配制大田生产杂交种子的不育系和恢复系种子。 4 原理 简单重复序列分布于水稻整个基因组，每个位点上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全 相同，因而造成了对应座位上的多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列， 因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离，分 析其长度多态性，达到区别不同于杂交种的目的。 5 核心引物确定原则 在水稻基因组上选取多态性、稳定性、重复性等综合特性好的引物作为核心引物（推荐引物序列见 附录A、附录B）。其中附录A引自 NY/T 1433-2007 水稻品种鉴定DNA指纹方法，附录B为湖北省现有两 系杂交水稻品种纯度SSR检测常用引物。 6 检测程序 6.1 样品数 从供检样品中随机取400粒种子按GB/T 3543.4-1995《农作物种子检验规程 发芽试验》标准中规定 的方法进行发芽，从发芽的幼苗中随机取192株幼苗进行检测。同时将标准的杂种及其父、母本设为对 照。 注：为增加室内SSR检测结果与田间鉴定结果的一致性，可随机选取192株正常幼苗进行检测。 6.2 DNA 提取 截取0.5cm-1cm长的水稻幼苗，加入40µl 1%NaOH溶液，在沸水中煮30s，然后加入60µl HCl-Tris溶液，在沸水中煮2min，取1µl进行PCR扩增。 6.3 2：1 特定引物筛选 利用亲本DNA，在核心引物中筛选出具有较好多态性、亲本间DNA片段差异较大，条带清晰的引物， 作为特定引物对供检样品进行检测。引物的选用还应考虑杂交种的生产情况，注意以下原则： a、对亲本纯度较高、去杂彻底，且制种田隔离效果较好的，一般选用一对引物即可。 b、对制种田隔离条件较差，有外源花粉污染的，应根据外源花粉类型增加引物对原模板DNA进行再 检测。 c、对亲本中杂株较多，或去杂不严的，应根据亲本杂株类型增加引物对原模板DNA进行再检测。 6.4 6.4.1 PCR 扩增 反应体系 10µl的反应体系包含10µM正反引物各0.2µl，10mM的dNTP 0.2µl，2U/µl的 0.6µl AmpliTaq Gold DNA 聚合酶， 10倍PCR反应液（100mmol/L Tris-HCl，pH8.3，15mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.01%的 明胶）1µl，1µl模板DNA（约10ng）和6.8µl超纯水。 6.4.2 2 反应程序 DB42/T 800—2012 94℃变性4min，然后是94℃15s、55℃15s、72℃30s进行35个循环，最后72℃延伸5min。 注：此程序中55℃15s，其温度为参考温度，实际操作时可根据厂家提供的引物说明书设置。 6.5 谱带分离 6.5.1 凝胶配制 称取 4g Nusieve3:1 琼脂糖，加入 96ml 1 倍 TAE 缓冲液，室温下放置 30min，在微波炉中煮沸 8min， 用蒸馏水加至原来体积，待冷却至 60℃左右时，加入 5µl 溴化乙锭溶液并混匀，倒入 12×12cm 的制胶 盒中，插好制胶梳，冷却后，缓慢抽去制胶梳，置于电泳槽中，用于上样。 注：上样孔在电泳槽负极方向 6.5.2 上样 用移液器依次取约 10µl 扩增产物，按顺序点于上样孔。每排上样孔分别点 100bp～600bp 父、母亲本种子的 DNA 扩增产物作为对照。 6.5.3 marker、 电泳、成像 将上样的琼脂糖凝胶置于电泳槽内，接通电泳仪电源，设置合适的电压值，(一般为 6V/cm -10V/cm)， 电泳约 30min。电泳完毕后，取出凝胶置于保鲜膜上，放入凝胶成像仪中观察并拍照。 7 结果计算 以亲本作对照，鉴定各样品电泳谱带的特征和一致性，判定杂株类型。其带型与母本一致的定为不 育系杂株，其他与杂种带型不一致的定为其他杂株。然后按下列公式计算纯度值 X. 实际检测样品幼苗株数-不育系杂株数-其他杂株数 X（%）= ————————