ICS 65.020.30 B 44 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB 35/T 989—2010 猪瘟活疫苗原料兔 Rabbit for making Classical swine fever vaccine,live 2010 - 03 - 17 发布 福建省质量技术监督局 2010 - 03 - 20 实施 发 布 DB35/T 989—2010 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：福州市农业科学研究所、福州大北农生物技术有限公司、连江县刘氏兔业养 殖场。 本标准主要起草人：曾彦钦、吴润生、陈先进、翁志铿、刘友霖、林志坤、陈震。 I DB35/T 989—2010 猪瘟活疫苗原料兔 1 范围 本标准规定了猪瘟活疫苗原料兔的品种、日龄及体重、技术要求、检验规则、运输和使用管理。 本标准适用于猪瘟活疫苗原料兔的生产和使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14926.1 实验动物 沙门菌检测方法 GB/T 14926.3 实验动物 耶尔森菌检测方法 GB/T 14926.4 实验动物 皮肤病原真菌检测方法 GB/T 14926.21 实验动物 兔出血症病毒检测方法 3 GB/T 18448.1 实验动物 体外寄生虫检测方法 GB/T 18448.2 实验动物 弓形虫检测方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 猪瘟活疫苗原料兔 rabbit for making Classical swine fever vaccine,live 家兔饲养过程中，执行了NY 5030、NY 5032、NY 5131和NY/T 5133，并按《中华人民共和国兽药典》 生产检验用动物标准规定的普通级动物标准检验，结果合格，用于制造猪瘟活疫苗（兔源）的家兔。 4 品种 成年体重≥3 ㎏的中、大型家兔品种（系）和杂交兔。 5 日龄及体重 5.1 日龄 日龄宜≥105 天。 5.2 体重 与规定日龄相对应的常用家兔品种（系）体重宜为： 獭兔体重≥2.5kg， 1 DB35/T 989—2010 日本大耳兔体重大型≥2.8kg（中型≥2.25kg） ， 大耳黄兔体重≥2.5kg， 虎皮黄兔体重中型≥2.5kg（标准型≥2.25kg） ， 哈白兔体重≥3kg， 新西兰兔体重≥2.5kg， 比利时兔体重≥3kg， 塞北兔体重≥2.8kg， 杂交兔（福建黄兔和上述品种杂交）体重≥2.25kg。 6 技术要求 猪瘟活疫苗原料兔的技术要求和相应的试验方法应符合表 1 的规定。 表1 技术要求 项 目 要 外 观 体 温 求 外观健康、无异常 38℃～39.8℃、且每日最高最低体温差不超 试 验 方 法 目 测 按附录 A 检验 过 0.5℃。 病 兔出血症病毒 按 GB/T 14926.21 检验 原 沙门菌 按 GB/T 14926.1 检验 微 假结核耶尔森菌 不 生 小肠结肠炎耶尔森菌 得 物 皮肤病原真菌 检 按 GB/T 14926.4 检验 体外寄生虫（节肢动物） 出 按 GB/T 18448.1 检验 寄生虫 弓形虫 猪 瘟 抗 体 7 检验规则 7.1 组批 每个兔场每日出栏的兔为一个批次(生产单元)。 7.2 抽样 7.2.1 抽样数量 根据每批兔子数量,取样量按表 2 执行。 2 按 GB/T 14926.3 检验 按 GB/T 18448.2 检验 按附录 B 检验 DB35/T 989—2010 表2 项 目 取样数量 群体大小,只 取样数量 病原微生物、弓形虫 （猪瘟抗体和体 ＜100 不少于 5 只 外寄生虫的取样数加倍） 100～500 不少于 10 只 ＞500 不少于 20 只 7.2.2 抽样方式 在每一生产单元的不同方位(如四角和中央)选取兔子。 7.2.3 送检 样品容器应按要求编号和标志，包装好，安全送达实验室，并附送检单，写明品种品系、数量和检 查项目。 7.3 出场检验 每批兔子出场时，需经相关检疫检验部门检验合格，并附有合格证明后，方可出场，出场检验项目 为外观、体温、猪瘟抗体和体外寄生虫。 7.4 定期检验 定期检验项目为兔出血症病毒、沙门菌和弓形虫，定期检验每三个月至少进行一次。 7.5 必要时检验 当从国外引进、怀疑有本病流行或选择原料兔场时，必须增加检测假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶 尔森菌、皮肤病原真菌。 7.6 结果判定 7.6.1 个体判定 外观或体温不符合要求的个体判为不合格。 7.6.2 批次判定 检验结果中， 只要有一只兔子的猪瘟抗体、病原微生物和寄生虫中的任何一项指标不符合要求， 则判定该批兔子为不合格。 8 运输 运输前，所使用的车辆和兔笼须先消毒。夏季运输，应在晚间进行，车内温度≤30℃。选用装 3 只～5 只的小笼子；兔子之间不拥挤。装车后，从最上层喷水，将兔毛喷湿。 9 使用管理 3 DB35/T 989—2010 按兽药 GMP 要求管理。 4 DB35/T 989—2010 AA 附 录 A （规范性附录） 猪瘟活疫苗原料兔体温测量法 A.1 测量环境 A.1.1 温度为20℃～25℃。 A.1.2 无剧烈的噪音。 A.1.3 湿度为40%～60%。 A.1.4 光照为1001ux～2001ux。 A.2 测量器材和试剂 兽用体温计、70%酒精棉球、清水、凡士林膏、兔专用固定架。 A.3 测量方法 将体温计甩至 35 摄氏度以下，用 70%酒精棉球消毒，涂以凡士林膏，右手持体温计慢慢插入肛门 约 6cm 深，2 分钟后取出，用酒精棉球拭净后读数并记录，保留小数点后一位。一天测 2 次，上、下午 各一次，连测 2 天。 A.4 结果判定 4 次的数值均在 38.0℃ ～39.8℃，且最高最低温差不超过 0.5℃的兔判为合格。 5 DB35/T 989—2010 附 录 B （规范性附录） 猪瘟活疫苗原料兔的猪瘟正向间接血凝试验（IHA） B.1 原理 用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA） 。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼 看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体 的反应灵敏性。这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。 B.2 试验器材和试剂 B.2.1 96孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板 B.2.2 微量移液器（50μL 25μL）取液塑咀 B.2.3 微量振荡器 B.2.4 猪瘟血凝抗原 B.2.5 猪瘟阴性对照血清 B.2.6 猪瘟阳性对照血清 B.2.7 稀释液 B.2.8 待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟 B.3 试验方法 B.3.1 加稀释液 在血凝板上 1-6 排的 1-6 孔；第 7 排的 1-3 孔第 5-6 孔；第 8 排的 1-12 孔各加稀释液 50μL。 B.3.2 稀释待检血清 取 1 号待检血清 50μL 加入第 1 排第 1 孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧 3-5 次混匀（避 免产生过多的气泡） ，从该孔取出 50μL 移入第 2 孔，混匀后取出 50μL 移入第 3 孔……直至第 6 孔混 匀后取出 50μL 丢弃。此时第 1 排 1-6 孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2⑴、1:4⑵、1:8 ⑶、1:16⑷、1:32⑸、1:64⑹。 取 2 号待检血清加入第 2 排；取 3 号待检血清加入第 3 排……均按上法稀释，注意！每取一份血 清时，必须更换塑咀一个。 B.3.3 稀释阴性对照血清 6 DB35/T 989—2010 在血凝板的第 7 排第 1 孔加阴性血清 50μL，对倍稀释至第 3 孔，混匀后从该孔取出 50μL 丢弃。 此时阴性血清的稀释倍数依次为 1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶。第 5-6 孔为稀释液对照。 B.3.4 稀释阳性对照血清 在血凝板的第 8 排第 1 孔加阳性血清 50μL，对倍数稀释至第 12 孔，混匀后从该孔取出 50μL 丢 弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为 1：2-1：4096。 B.3.5 加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加猪瘟血凝抗原（充分 摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。 B.3.6 振荡混匀 将血凝板置于微量振荡器上 1-2 分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸 上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或 37℃下静置 1.5-2 小时判 定结果。 B.4 结果判定 B.4.1 移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:2～1:8孔，稀释液对照孔，均应无凝 集“-” （血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点） 。 B.4.2 阳性血清对照1:2-1:256各孔应出现“++++”—“++”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血 球悬浮于孔内） 。 B.4.3 在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清 的抗体效价。例如1号待检血清1-2孔呈现“++++”—“++”凝集，3孔呈现“+”或“-”凝集，第4孔呈 现“-”凝集，那么就判定该份血清的猪瘟抗体效价为1:4。用本方法重复一次，如猪瘟抗体效价仍为1: 4，则判该只原料兔不合格。全部待检血清的猪瘟间接血凝抗体效价≤1:2，为合格。 B.5 注意事项 B.5.1 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 B.5.2 勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。　 B.5.3 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37℃恒温 箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1： 1混合） ，48小时捞出后清水冲净。 B.5.4 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。 “-”表示完全不凝集或 0-10%血球凝集。 “+”表示 10-25%血球凝集。 “++”表示 50%血球凝集。 7 “+++”表示 75%血球凝集。 “++++”表示 90-100%血球凝集。 B.