ICS 11.220 B 41 备案号：33857-2012 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 826—2012 奶牛隐性子宫内膜炎 MPO 诊断方法 The MPO diagnosis method of subclinical endometritis for dairy cow 2012-03-29 发布 湖北省质量技术监督局 2012-05-01 实施 发 布 DB42/T 826—2012 目  次 前言....................................................................................................................................................................... II 1 范围................................................................................................................................................................... 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................... 1 3 缩略词和术语................................................................................................................................................... 1 4 原理................................................................................................................................................................... 1 5 实验室条件....................................................................................................................................................... 1 6 临床症状........................................................................................................................................................... 1 7 实验室检测....................................................................................................................................................... 2 7.1 样品采集................................................................................................................................................... 2 7.2 样品处理................................................................................................................................................... 2 7.3 检测步骤................................................................................................................................................... 2 7.4 结果计算................................................................................................................................................... 2 8 结果判定........................................................................................................................................................... 2 附录 A（资料性附录） 髓过氧化物酶法（MPO）灵敏度、准确性、临床验证............................................. 3 附录 B（资料性附录） MPO 与 PGF2α及 E2 检测结果比对..............................................................................4 I DB42/T 826—2012 前  言 本标准按照 GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学动物医学院提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：郭定宗、尹红斌、杨世锦、周东海、李家奎、郭 锐。 II DB42/T 826—2012 引  言 奶牛隐性子宫内膜炎是在子宫复原后（产后 8 周后），发生于子宫内膜组织的一种慢性、不明显的 子宫炎性过程。因为其病理分泌物的量少或者阙如，造成了临床诊断和治疗困难。隐性子宫内膜炎可导 致母牛不孕症，而不孕症引起产犊间隔延长、繁殖率降低、产奶量下降、饲养成本增高，是困扰奶牛产 业发展的一大难题。在奶牛隐性子宫内膜炎的炎症反应中，中性粒细胞是其主要的免疫细胞。存在于中 性粒细胞的髓过氧化物酶（MPO）在其吞噬致炎因子过程中被释放于子宫腔内。 本研究利用奶牛子宫回收液中髓过氧化物酶（MPO）的含量与隐性子宫内膜炎有极强的相关性，建 立了奶牛隐性子宫内膜炎MPO诊断方法，该方法具有准确度高、成本低等特点，便于基层推广使用。 III DB42/T 826—2012 奶牛隐性子宫内膜炎 MPO 诊断方法 1 范围 本标准规定了奶牛隐性子宫内膜炎髓过氧化物酶检测法的缩略语、原理、测定方法、结果判定等。 本标准适用于奶牛隐性子宫内膜炎早期诊断、监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略词和术语 MPO 髓过氧化物酶 PMN 中性粒细胞 PGF2α 前列腺素 2α E2 雌激素 OD 光密度 呼吸爆发在炎症过程中，激活的中性粒细胞耗氧量显著增加，产生大量氧自由基，又称为氧爆发。 酶活力单位 每 mL 样品在 37℃的反应体系中 H2O2 被分解 1μmol 为一个酶活力单位。 4 原理 在奶牛隐性子宫内膜炎的发生发展过程中，存在于中性粒细胞中的髓过氧化物酶（MPO）通过呼吸 爆发释放于子宫中，是子宫内膜组织损伤的主要标识物。利用奶牛子宫回收液中的 MPO 含量与隐性子宫 内膜炎的相关性，以 MPO 作为隐性子宫内膜炎早期诊断的特异性因子，通过检测 MPO 浓度，诊断奶牛隐 性子宫内膜炎。 5 实验室条件 5.1 本实验应在生物安全 BSL-1 实验室进行，实验室环境和操作应符合 GB 19489 要求。 5.2 实验室应配备 MPO 检测试剂盒、倒置相差显微镜、分光光度计、酶标仪、移液器、精密酸度计、 超低温冰箱等器材。 6 临床症状 奶牛生产后 8 周发情屡配不孕，无特异性示病症状，疑似奶牛隐性子宫内膜炎。 1 DB42/T 826—2012 7 实验室检测 7.1 样品采集 掏空被检奶牛宿粪，用 5 %的高锰酸钾溶液冲洗肛门部及外阴周围，用 75 %酒精棉球对阴道边缘及 内侧进行消毒，向子宫内注入 20mL 灭菌生理盐水，直肠按摩子宫角 2min 后回收子宫液 5mL。放置 4℃ 保存，2h 内 1200r/min、5min 离心，取上清液-70℃保存。 7.2 样品处理 7.2.1 将样品用 MPO 试剂盒中的试剂 2 制备成 5%的组织匀浆 10mL。 7.2.2 将上述组织匀浆用 MPO 试剂盒中的试剂 3 制备成 10%的被检样品 5mL，充分混匀后置 37℃水浴 10min，取出后待检。 7.3 检测步骤 按表1步骤进行操作。 表1 MPO检验步骤 步骤 处理过程 对照管 第1步 蒸馏水/mL 3.00 第2步 样本/mL 0.20 0.20 第3步 试剂 4/mL 0.20 0.20 第4步 显色剂/mL 第5步 第6步 第7步 3.00 混匀，37℃水浴 30 分钟 试剂 7/mL 0.05 MPO U /mL=(测定管 OD 值－对照管 OD 值)/11.3×取样量(mL) 结果判定 8.1 当 MPO 的活力单位≥3.2U/mL 时，判定为奶牛隐性子宫内膜炎阳性。 8.2 当 MPO 的活力单位<3.2U/mL 时，判定为奶牛隐性子宫内膜炎阴性。 2 0.05 混匀，60℃水浴 l0min，取出后用酶标仪检测 OD460nm 值，lcm 光径，用蒸馏水调零。 7.4 结果计算 8 测定管 DB42/T 826—201