ICS 67.080.20 B31 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 672-2010 双孢蘑菇菌种提纯复壮技术规程 Technical regulation of purification and rejuvenation for Agaricus bisporus 2010-12-17 发布 2011-01-18 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 DB42/T 672-2010 前 言 本标准由华中农业大学提出。 本标准起草单位：华中农业大学植物科技学院，农业部微生物产品质量监督检验测试中心（武汉）， 湖北省食用菌工程技术研究中心。 本标准主要起草人：边银丙、王卓仁、樊晓琳、李维琳、叶绿笋、徐章逸、刘丹丹。 I DB42/T 672-2010 双孢蘑菇菌种提纯复壮技术规程 1 范围 本标准规定了双孢蘑菇菌种提纯复壮技术规程的术语和定义、技术要求、菌种提纯复壮方法、菌种 质量的评价和提纯复壮结果的判定。 本标准适用于湖北省棚室层架栽培和露地栽培双孢蘑菇的菌种提纯复壮。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 12728-2006 食用菌术语 GB 19171 双孢蘑菇菌种 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 NY/T 5333-2006 无公害食品 食用菌生产技术规范 《食用菌菌种管理办法》（2006年3月27日农业部令第62号公布） 3 术语和定义 GB/T12728-2006 中界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了便于使用，以下重复列出了 GB/T12728-2006 中的某些术语和定义。 3.1 菌种纯度 culture purity 指某一菌种只含有特定品种的菌丝体。 3.2 菌种活力 culture vigour 菌种活力包括萌发能力、定植能力和吃料能力。 3.3 待检菌种 tested culture 指由委托方提供的需要判定是否提纯复壮的菌种。 3.4 标准菌种 standard culture 指由法定菌种保藏机构进行科学保藏的、菌种来源明确且种性稳定、活力正常的菌种，包括标准母 种（一级菌种）、标准原种（二级菌种）和标准栽培种（三级菌种）。 1 DB42/T 672-2010 3.5 菌种退化 culture degeneration 菌种在生长和栽培过程中，由于遗传变异导致优良性状下降。 3.6 菌种提纯 culture purification 使菌种得到进一步纯化，并保持菌种优良性状的技术措施。 3.7 菌种复壮 culture rejuvenation 良种繁育中防止菌种退化的技术措施。 3.8 复壮菌种 rejuvenated culture 通过一定的技术措施恢复了原有优良性状的菌种 4 技术要求 4.1 检验场地选择 检验场地所处的环境应不影响检验结果的有效性或不对其所要求的测量准确度产生不利的影响。检 验场地的检验工作区域、能源、采光、控温、通风等应该保证有利于正常检验工作的进行。 4.1.1 显微镜观察室 显微镜观察室应干燥、通风、环境卫生洁净。显微镜所在试验台有局部照明，远离水源。 4.1.2 微生物培养室 微生物培养室内保证干燥、通风，具有紫外灯等消毒条件，能采取适当措施与外间安全隔离。产孢 培养物应密闭培养，以防止孢子飞散。 4.2 栽培场所和栽培基质要求 栽培场所应符合 NY/T 5333-2006 的要求。栽培基质应符合 NY 5099 的要求。 5 菌种提纯复壮方法 5.1 子实体组织分离法 5.1.1 选取形态具有该品种典型特征、六、七分成熟、无病斑、无虫蛀、无污损的子实体； 5.1.2 在无菌条件下，用无菌水将子实体表面反复冲洗干净，用解剖刀在菌盖和菌柄中部纵切，挑取 菌柄与菌盖交接处的小块菌髓，转入 PDA 斜面培养基，于 25℃条件下培养，供制备一级菌种用。 5.2 菌丝尖端分离法 无菌操作条件下，在双目放大镜下挑取菌落上菌丝尖端约 5mm 长度的单根菌丝，转至 PDA 斜面 培养基中培养，供制备一级菌种。 5.3 2 原生质体再生法 DB42/T 672-2010 5.3.1 收集培养 7-10d 的幼嫩菌丝，采用 2.0%溶壁酶（Lywallzyme）和 7.0%蜗牛酶（Snailase）的混 合酶液进行酶解，获取原生质体混合液；将原生质体混合液过滤、离心，采用 0.6M 甘露醇等渗液洗涤 两次； 5.3.2 吸取适量的原生质体稀释液，均匀涂布到附录 A.1 中的再生培养基平板上，于 25℃条件下进行 恒温培养； 5.3.3 挑取再生培养基上出现的星芒状微小菌落，转移到附录 A.2 中 PDPY 培养基的斜面培养基中培 养，供制备一级菌种用。 6 菌种制作 按照 GB 19171 的方法制作。 7 菌种种性评价 7.1 菌种种性质量要求 7.1.1 感官特性 应符合 GB 19171 的质量要求。 7.1.2 生物学特性 表1 项 菌种生物学特性的质量要求 目 质量要求 母种菌丝生长速度 应符合 GB 19171 的质量要求 原种、栽培种菌丝生长速度 应符合 GB 19171 的质量要求 菌丝生长温度范围 应符合双孢蘑菇(5~30)℃的温度范围要求，待检 菌种和标准菌种相差不应超过 2℃ 菌丝生长最适生长温度 应符合双孢蘑菇(24±1)℃的温度范围要求，待检 菌种和标准菌种相差不应超过 2℃ 菌丝生长最适 pH 值 应符合双孢蘑菇 pH6.5~7.0 的 pH 范围要求，待 检菌种和标准菌种最适 pH 相差不应超过 0.5 7.1.3 农艺性状 表2 项 菌种萌发定植能力 目 菌种农艺性状的质量要求 质量要求 母种、原种转接及栽培种播种后应在 24h 之内萌 发定植 3 DB42/T 672-2010 表 2（续） 菌种农艺性状的质量要求 结菇转潮能力 覆土厚度(3～4)cm,平均 3.5cm;覆土后(12～16)d 开始出菇，(18～22)d 开始采收，每潮间隔(7～10)d 生物学效率 待检菌种与标准菌种的差异值不超过 5% 第 1 潮和第 2 潮菇的产量 待检菌种与标准菌种之间不存在显著性差异 菇形、质地、色泽 待检菌种与标准菌种没有明显差异 菇盖直径和厚度、菇柄长度和直径； 待检菌种与标准菌种之间不存在显著性差异 7.2 菌种种性的评价方法 7.2.1 感官检验 7.2.1.1 肉眼观察 按照 GB 19171 的方法，肉眼观察菌种外观和容器。 7.2.1.2 鼻嗅 按照 GB 19171 的方法，用鼻子嗅菌种是否有酸臭、霉等异味。 7.2.1.3 菌丝显微观察 在载玻片上滴一滴无菌水，用解剖针挑取待检菌株少许活化的菌丝于水滴上，盖上盖玻片。先用 10 倍物镜观察，再转到 40 倍物镜下观察菌丝的形态结构，测量菌丝细胞的宽度，同时与标准菌种比较， 观察两者在菌丝直径、分支密度、分枝特征等方面有无明显差异。观察不少于 50 个不同视野。 7.2.2 生物学特性检验 7.2.2.1 菌丝生长速度 按照 GB 19171 中的检测方法进行。 7.2.2.2 温度 将待检菌种与标准菌种进行活化，将直径约 5mm 的接种块接种到附录 A.3 的母种 PDA 培养基平皿 中（直径 90mm），分别在 5℃、10℃、15℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、 34℃、36℃下培养，观察待检菌种与标准菌种在相同温度下的生长速度。 7.2.2.3 pH 值 取待检菌种活化的菌丝块接入于不同酸碱度(pH4~11)的平板培养基上，置于适宜的温度下培养。当 菌落直径达 1cm~2cm 时，在菌落边缘画线作为生长起始线，继续培养。当菌丝快长满皿时，再画一条 终止线。测量起始线与终止线之间的距离，计算菌丝生长速度，获得菌丝生长适宜的 pH 范围和最适 pH 值。 7.2.3 农艺性状检测 7.2.3. 菌种萌发定植能力检测 将待检菌转接到附录 A.3、附录 A.4 和附录 A.5 的培养基(料)中，(24±2)℃培养，肉眼观察菌丝的 萌发定植情况。 7.2.3.2 子实体形态观察 将待检菌种与标准菌种制种，在附录 A.5 的培养料中进行出菇试验。按常规方法栽培出菇后进行子 实体形态观察。 7.2.3.3 结菇转潮能力 将待检菌种与标准菌种制种，在附录 A.5 的培养料中进行出菇试验。覆土厚度 3cm～4cm，观察覆 土后的出菇时间、采收时间和转潮间隔时间。 4 DB42/T 672-2010 7.2.3.4 产量性状 制作待检菌种和标准菌种的三级菌种，按照附录 A.5 中的培养料配方制作栽培料进行栽培试验，试 验采用随机区组排列，不少于 3 次重复，每小区不少于 3 平方米，设保护区和保护行。统计待检待检菌 种与标准菌种的单位面积产量，进行差异显著性检验。 7.2.3.5 生物学效率 统计第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇的鲜重，分别计算待检菌种和标准菌种的生物学效 率，再比较两者生物学效率的差异。 8 菌种活力评价 8.1 菌种活力的质量要求 8.1.1 菌丝萌发定植能力 菌丝应在 24h 以内萌发定植。 8.1.2 菌丝生长速度 应符合GB 19171的质量要求。 8.2 菌种活力评价方法 8.2.1 菌丝萌发能力 按无菌操作要求，挑取小块待检菌种的菌丝块，转接到 PDA 培养基平板(或斜面)培养基上，置于(24 ±2)℃的温度下培养，观察其萌发出新菌丝的能力。 8.2.2 菌丝生长速度 按照 GB 19171 规定的方法进行检验。 9 菌种纯度评价 9.1 菌种纯度质量要求 应符合 GB 19171 规定的质量要求。 9.2 菌种纯度评价方法 9.2.1 肉眼观察 在光线适宜的条件下，肉眼观察装有菌种的容器中是否混有细菌、霉菌、螨虫、线虫等其它生物及 其代谢物。 9.2.2 细菌和霉菌的检测 按照 GB 19171 规定的方法进行检测。 9.2.3 螨虫和线虫检测 用接种针挑取取少许待检菌种的菌丝于载玻片上水滴中，盖上盖玻片，用 10 倍或 40 倍物镜观察不 少于 50 个视野，检查是否有螨虫或线虫存在。 10 待检菌种提纯复壮试验结果的判定 菌种质量的判定按菌种种性、菌种纯度和菌种活力的质量要求进行。待检菌种全部检验项目与标准 菌种没有显著差别，或者优于标准菌种时，则判定其为提纯复壮菌种。 5 DB42/T 672-2010 附 录 A （规范性