ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 795—2012 禽流感病毒乳胶凝集检测方法 Method of the latex agglutination for the detection of avian influenza virus 2012 - 01 - 06 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 03 - 01 实施 发 布 DB42/T 795—2012 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 术语和定义..................................................................................................................................................... 1 3 实验原理......................................................................................................................................................... 1 4 实验条件......................................................................................................................................................... 1 5 实验材料......................................................................................................................................................... 1 6 样品处理......................................................................................................................................................... 2 7 实验方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 2 9 注意事项......................................................................................................................................................... 3 附录 A.................................................................................................................................................................... 4 I DB42/T 795—2012 前  言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫 病预防控制中心。 本标准起草人：金梅林、钟广汉、但汉并、郭学波、徐高原、张安定、周艳君、孙小美、李淑云。 II DB42/T 795—2012 引  言 禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）具有易变异的特点，可通过突变获得对人的感染和致病 能力，导致重大的公共卫生危害。为加强禽流感监测，制定了《禽流感病毒乳胶凝集试验检测方法》， 本方法具有简便、快速的优点，尤其适合基层现场使用。 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到《一种禽流感病毒乳胶凝集检测试剂 盒及应用》（专利号：ZL200510019512.3）相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名：金梅林、陈剑锋、喻正军、张安定、李红超、陈焕春。 地 址：武汉市洪山区狮子山街1号华中农业大学 邮政编码：430070 联系电话：027-87282608 传 真：027-87282608 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及其他专利。本文件的发布机构不承担识别这些 专利的责任。 III DB42/T 795—2012 禽流感病毒乳胶凝集检测方法 1 范围 本标准规定了禽流感病毒的乳胶凝集试验检测方法的术语和定义、实验原理、实验条件、实验材料、 样品处理、实验方法、结果判定和注意事项等。 本标准适用于禽类咽/鼻拭子、肛拭子、内脏组织、鸡胚尿囊液、细胞培养物中禽流感病毒的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 乳胶（Latex）：聚合物微粒分散于水中形成的胶体乳液。 3 实验原理 禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体致敏固相载体羧化聚苯乙烯微球，当与相应的抗原反应时，可形成 肉眼可见的凝集颗粒。 4 实验条件 4.1 实验室 实验操作宜在常温（18 ℃～25 ℃）进行。 4.2 仪器 台式低温高速离心机、微量移液器、冰箱、玻片、吸头。 4.3 人员 注意个人防护和环境保护。 5 实验材料 5.1 乳胶诊断液 5.2 阳性对照 含禽流感病毒的鸡胚尿囊液灭活处理。 5.3 阴性对照 未接种禽流感病毒的鸡胚尿囊液。 1 DB42/T 795—2012 5.4 样品处理液 A 配制见附录第A.1章 5.5 样品处理液 B 配制见附录第A.2章 6 样品处理 6.1 咽/鼻拭子和肛拭子 用无菌棉拭子于禽的咽喉或鼻腔、泄殖腔中沾取渗出液，然后浸泡于 1 mL 样品处理液 B 中，剧烈 震荡 1 min 后挤出棉拭子中的液体，冻融 3 次后于 37 ℃感作 15 min，置 2 ℃～8 ℃，12,000 r/min 离 心 5 min，取上清。 6.2 内脏组织 剪取组织块 0.5 g，置于研磨器中，加样品处理液 A 1 mL，研磨后取出组织浸出液，冻融 3 次，然 后于 2 ℃～8 ℃，12,000 r/min 离心 15 min，取上清。 6.3 鸡胚尿囊液 鸡胚尿囊液样品，12,000 r/min 离心 5 min，取上清。 6.4 细胞培养物 细胞培养物可直接用于检测或者冻融一次后检测。 7 实验方法 取样品、阳性对照、阴性对照各 8 µL～10 µL，分置于黑色背景的玻璃片上。各加等量的乳胶试剂， 用纤细洁净物（牙签等）搅匀，使液面直径达到 1.5 cm 左右，前后左右缓慢连续摇动 30 sec，并在 1 min 内观察记录结果。 8 结果判定 8.1 凝集反应可能出现以下几种结果： a）“++++” b）“+++” c）“++” d）“＋” e）“－” 8.2 全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； 大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍混浊； 约 50％胶乳凝集，但颗粒较细，液体较混浊； 有少许凝集，液体呈混浊： 液滴呈原有的均匀乳状。 成立条件 30 sec～60 sec 内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照样品与乳胶诊断液进行乳胶凝集反应， 应出现“++”以上凝集；阴性对照样品与乳胶诊断液进行乳胶凝集反应，应不凝集。 2 DB42/T 795—2012 8.3 结果判断 30 sec～60 sec 内出现“++”以上凝集，判为阳性；30 sec～60 sec 内液滴呈原有的均匀乳状为阴性。 9 注意事项 实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。 3 DB42/T 795—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 样品处理液A 四硼酸钠（Na2B4O7•10H2O） 13.3 g 硼酸（H3BO3） 16.08 g 氯化钠（NaCl） 8.5 g 加蒸馏水或去离子水 800 mL，调 pH 值至 8.4 后定容至 1000 mL。置 2 ℃～