ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 789—2012 猪链球菌 2 型 ELISA 抗体检测方法 Method of the enzyme-linked immunosobent assay for the detection of atibodies against swine streptocosus suis serotype 2 2012 - 01 - 06 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 03 - 01 实施 发 布 DB42/T 789—2011 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 缩略词............................................................................................................................................................. 1 3 实验原理......................................................................................................................................................... 1 4 实验条件......................................................................................................................................................... 1 5 实验材料......................................................................................................................................................... 1 6 样品处理......................................................................................................................................................... 1 7 实验方法......................................................................................................................................................... 2 8 结果判定......................................................................................................................................................... 2 9 注意事项......................................................................................................................................................... 2 附录 A.................................................................................................................................................................... 3 I DB42/T 789—2011 前  言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫 病预防控制中心。 本标准主要起草人：金梅林、康超、张安定、钟广汉、周艳君、董晓辉、陈焕春、徐高原、孙小美、 李淑云、宋念华。 II DB42/T 789—2011 引  言 猪链球菌（Streptococcus suis, SS）是一种能引起猪发病的重要致病菌，往往造成猪群感染和大量死 亡，同时严重危害人类健康甚至导致死亡。根据荚膜多糖分型，猪链球菌可分为 33 个血清型，其中猪 链球菌 2 型是毒力最强、流行最广的血清型。为了有效地预防和控制猪链球菌 2 型病，制定了《猪链球 菌 2 型 ELISA 抗体的检测方法》，本方法快速、简便，易操作，是监测猪 2 型链球菌病的重要方法。 III DB42/T 789—2011 猪链球菌 2 型 ELISA 抗体检测方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌 2 型 ELISA 抗体的检测方法的缩略词、实验原理、实验条件、实验材料、 样品处理、实验方法、结果判定和注意事项等。 本标准适用于检测猪血清中的猪链球菌 2 型抗体。 2 缩略词 下列术语和定义适用于本文件。 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）：酶联免疫吸附试验 OD630nm值：630纳米波长处的吸光值 3 实验原理 酶联免疫吸附试验是将抗原吸附在固相载体上，加入待检抗体，再加相应的酶标记抗体，生成抗原 -待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗 体的量。本方法中采用冷酚抽提法，提取并纯化猪链球 2 型菌的荚膜多糖，以其作为包被抗原，建立检 测猪链球菌 2 型抗体的 ELISA 检测方法。 4 实验条件 4.1 实验室 实验操作宜在常温（18 ℃～25 ℃）进行。 4.2 仪器 抗原包被板、微量移液器、移液器吸头、酶标检测仪、恒温箱、冰箱。 4.3 人员 注意个人防护和环境保护。 5 实验材料 20 倍浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标记抗体、底物液 A、底物液 B、终止液、阳性对照血清、阴 性对照血清。配方见附录 A。 6 样品处理 1 DB42/T 789—2011 6.1 样品采集 取动物全血，待血液凝固后，4,000 r/min 离心 10 min，收集上清。要求血清清亮，无溶血。 6.2 洗涤液配制 使用前，将 20 倍浓缩洗涤液恢复至室温（20 ℃～25 ℃），并摇动使沉淀溶解（37 ℃水浴锅中加 热 5 min～10 min），然后用蒸馏水稀释 20 倍，混匀，稀释好的洗涤液在 2 ℃～8 ℃贮存，7 d 内使用。 6.3 样品和对照血清稀释 处理后的样品按 1:40 的比例稀释；阳性和阴性对照血清用样品稀释液按 1:40 稀释。 7 实验方法 7.1 取抗原包被板，用洗涤液洗板 1 次（200 µL/孔）后在吸水纸上拍干。 7.2 加入稀释好的样品，每孔 100 µL，同时设阴、阳性对照孔，每孔 100 µL，置 37 ℃作用 30 min。 7.3 弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 200 µL，静置 3 min 后，弃去洗涤液，并在吸水纸上 拍干，重复洗板 5 次。 7.4 加入酶标记抗体，100 µL/孔，置 37 ℃作用 30 min。 7.5 弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 200 µL，静置 3 min 后，弃去洗涤液，并在吸水纸上 拍干，重复洗板 5 次。 7.6 每孔加底物液 A、底物液 B 各 50 µL，混匀，室温避光显色 10 min。 7.7 每孔加入终止液 50 µL，混匀后测定结果。 7.8 以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔的 OD630nm 值。测定结果必须在加入终止液后 10 min 内完 成。 8 结果判定 试验成立的条件是阳性对照孔 OD630nm 值≥0.8，阴性对照孔 OD630nm 值＜0.3。 如果样品 OD630nm 值≥0.35，判为阳性； 如果样品 OD630nm 值＜0.35，判为阴性。 9 注意事项 实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。 2 DB42/T 789—2011 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配置 A.1 样品稀释液的配制 脱脂乳 50 g 氯化钠（NaCl） 160 g 氯化钾（KCl） 4g 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 58 g 磷酸二氢钾（kH2PO4） 4g Tween-20 5 mL 硫柳汞钠 0.1 g 加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL,经 0.22 µm 滤膜过滤后，无菌分装，50 mL/瓶。 A.2 20 倍浓缩洗涤液的配制 氯化钠（NaCl） 160 g 氯化钾（KCl ） 4g 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 58 g 磷酸二氢钾（kH2PO4） 4g Tween-20 5 mL 加蒸馏水或去