ICS 65.020.30 B 41 备案号：25946-2009 广 DB44 东 省 地 方 标 准 DB44/T 664—2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感 （H5 亚型）的 HI 和多重 RT-PCR 鉴别诊断技术操作规程 HI and multiplex RT-PCR for detection and differentiation between GPMV and H5 subtype of AIV in goose 2009-08-06 发布 广东省质量技术监督局 2009-12-01 实施 发布 DB44/T 664—2009 前 言 本标准附录A、附录B和附录C为规范性的附录。 本标准由广东省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：华南农业大学兽医学院。 本标准主要起草人：任涛、徐成刚、罗开健、曹伟胜、袁少华、廖明、张桂红、辛朝安。 I DB44/T 664—2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感（H5 亚型）的 HI 和多重 RT-PCR 鉴别诊断技术操作规程 1 范围 本标准规定了应用血凝抑制试验（HI试验）和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术鉴别诊断鹅的 禽副粘病毒病与H5禽流感的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修 改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否 可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术。 3 术语和定义 GB/T 18936 确定的以及下列术语和定义适用于本标准。 3.1 鹅的禽副粘病毒病 是近年来的新病，是由鹅的禽副粘病毒（Goose Paramyxovirus ,GPMV）引起的鹅的一种高发病率、 高死亡率的烈性传染病，以消化道充血、出血为特征的急性传染病。 3.2 高致病性禽流感 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus 是由正黏病毒科流感病毒属的禽类高致病性 A 型流感病毒(主要为 H5 亚型)引起的一类急性、高接触 性的禽类烈性传染病，具有高发病率和高死亡率的临床特征。 3.3 红细胞凝集试验 是指感染禽类的某些病毒与红细胞发生结合出现红细胞凝集的现象。 3.4 血凝效价 是指红细胞凝集试验中出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以 log2 为单位。 3.5 红细胞凝集抑制试验 即 HI 试验，是指使用特异性免疫血清可以抑制某些感染禽类的病毒与红细胞凝集的现象。 3.6 血凝抑制效价 是指 HI 实验中不出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以 log2 滴度为单位。 3.7 四单位抗原 根据抗原 HA 效价结果进行稀释，配制出血凝效价为 2 个 log2 单位的抗原稀释液。 1 DB44/T 664—2009 3.8 反转录聚合酶链反应 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 是指利用反转录酶将病毒 RNA 反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增的检测方法。RT-PCR 使 RNA 检测的敏感性提高了几个数量级，使一些极为微量的 RNA 样品分析成为可能。 3.9 特异性引物 是指针对特定模板 DNA 基因片段设计的一小段与 DNA 片段两侧互补的人工合成寡核苷酸。 3.10 无 RNase 水 是指除去RNA酶活性的双蒸水。 4 HI 试验 4.1 仪器设备及材料 4.1.1 仪器设备：离心机，最大转速至少应达到 5000g；微量振荡器；96 孔 V 型板；5μL ～50μL 八道移 液器。 4.1.2 材料：1mL、10mL吸管；10mL离心管；2mL一次性注射器。pH值为7.4,浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓 冲溶液（PBS）；3.8%柠檬酸钠抗凝剂；1％鹅红细胞悬液；GPMV和HPAIV 抗原、标准血清以及阴性血清。 试剂的配方见附录B 4.2 采样与样品制备：每只鹅心脏或翼下采血 1mL～2mL,静置或离心，待血清析出后备用。 4.3 操作规程 4.3.1 HA 效价的测定 在96孔V型反应板的1孔～12孔均加入25μL PBS，换吸头；吸取GPMV或HPAIV 25μL于第1孔中混匀后 吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸取25μL弃去并换吸头；同样，换吸头后取25μL AIV进行在另外一排孔中进行同样的操作，有必要的话，每种抗原可以重复做一排；每孔加入25μL PBS； 吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL；置于微量振荡器上振荡30s，室温（20℃～25℃）静置40min 后观察结果；对照孔（12孔）红细胞应成明显纽扣状沉到孔底，此时根据完全血凝的最高稀释倍数得出HA 效价。 4.3.2 四单位抗原校正 用微量移液器向反应板的 2 孔～6 孔加 PBS 25μL,第 1 孔不加；根据 4.3.1 HA 效价的测定结果配制 四单位 GPMV 及 HPAIV 抗原，用微量移液器吸取 25μL 四单位抗原分别加入第 1 孔、第 2 孔中，从第 2 孔 开始混匀后吸出 25μL 至第 3 孔，依次倍比稀释到第 5 孔，弃去 25μL；每孔加入 25μL PBS；用微量移 液器再吸取 1%鹅红细胞悬液依次加入 1 孔～6 孔，每孔 25μL；于微量振荡器上振荡 30s；室温（20℃～ 25℃）静置 40min 后观察结果；如第 1、2、3 孔为完全凝集，第 4 孔红细胞为 50%沉淀，第 5 孔红细胞产 生 75%的沉淀，第 6 孔为对照完全沉淀，出现以上结果，表明所配四单位抗原准确，校正成立。否则，重 新测 HA 效价并且配制四单位抗原，然后再做校正直至出现以上结果。 4.3.3 HI 试验 每排孔检测1份血清,同时设立阳性血清对照和阴性血清对照,试验步骤如下:在微量反应板的1孔～11 孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；吸取待检血清25μL置于第1孔中，混匀后吸取25μL于第2孔， 依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL，弃去；1孔～11孔均加入4.3.2中配制好的四单位抗原25μL， 室温（20℃～25℃）静置至少30min。吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL；置于微量振荡器上 振荡30s，混合均匀，室温（20℃～25℃）静置40min后观察结果。 4.4 结果判定 将反应板倾斜成45º角，只有抗原对照孔（11孔）红细胞将成明显的纽扣状沉淀,红细胞对照孔（12孔） 成泪滴状流淌，才可以进行HI结果的判定。同时，只有阴性对照孔血清效价不大于2log2，阳性对照孔血清 2 DB44/T 664—2009 误差不超过1个log2，试验结果才有效。HI效价小于或等于3log2，判定HI试验阴性；HI效价等于4log2，判 定为可疑，需重复试验；HI效价大于或等于5log2，判定HI试验阳性。 5 RT-PCR 实验 5.1 仪器设备及材料 5.1.1 仪器设备：生物安全柜；PCR 仪；电泳仪；凝胶成像系统；小型台式高速低温离心机；水浴锅。 5.1.2 耗材：微量移液器(配有滴头)；0.5mL 或 0.2mL PCR 反应管；一次性手套；1.5mL 灭菌离心管。 5.2 材料 5.2.1 RNA 提取试剂；氯仿(分析纯或以上试剂)；DEPC 处理的无 RNase 去离子水；异丙醇(分析纯或以上 试剂)；无 RNase 水配制的 75% 乙醇；反转录随机引物(pd(N)6, 20µmol/L)、AMV 反转录酶 、核糖核酸酶 抑制剂（RNasin）；Ex-Taq 酶；2.5mmol/µL dNTP 混合物；凝胶加样缓冲液；1X Tris-冰乙酸电泳缓冲液； 10mg/mL 溴化乙锭（EB）；1.0% 琼脂糖凝胶（含 0.5µg/mL EB）；DNA 分子量标准（ DL2000）；PCR 扩增 引物（浓度分别为 25pmol/µL，见附录 B.1）。试剂的配制见附录 B。 5.2.2 病料的处理：按照国标 GB/T 18936 的 2.1 进行。 5.3 操作规程 5.3.1 核酸抽提 取 250μL5.2.2 中制备的病料组织上清液,置于一灭菌的 1.5mL 离心管中，同时设立阴性对照及鹅的 禽副粘病毒、H5 亚型禽流感病毒阳性对照，再分别加入冰冷的裂解液 750μL，剧烈混合样品 15s，室温放 置 5min。加入 200μL 氯仿，反转离心管混合 2 次，剧烈混合 10s，4 ℃下以 10 000g 离心 15min；吸取上 层水相 500μL 加入另一支灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入异丙醇 500μL，4 ℃放置 10min，4 ℃下以 10 000g 离心 15min；小心弃去全部上清液，加入 1 mL 75%乙醇，上下轻缓反转两次, 4 ℃下以 10 000g 离心 5min； 弃去全部上清，在超净工作台放置 5 min～10min，至管壁上无肉眼可见液体，即制得总 RNA；加入 DEPC 水溶液 20μL，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，冰浴保存备用，若需长期保存须放置在-70℃条件下。 5.3.2 RT 在一个 1.5mL 灭菌离心管中依次加入 5×AMV 缓冲液 2µL，2.5mmol/µL dNTP 混合物 2 µL，pd(N)6 1μL， RNasin 0.25 µL，AMV 反转录酶 2.5U，轻缓混匀；加入 6.25μL 5.3.1 制得 RNA；于室温放置 10 min ； 放入 42 ℃水浴中 1 h，然后冰浴 2 min，所得的反应液即为反转录产物 cDNA。cDNA 可置于-20℃保存或直 接做 PCR。 5.3.3 PCR 在一个 0.5mL 或 0.2mL 灭菌 PCR 管中依次加入: 无 RNase 水 19.3 µL，10×EX-Taq 缓冲液 2.5 µL， dNTP 混合物 1 µL，引物 PP1、PP2、 PP3 和 PP4 各为 0.5µL，EX-Taq 酶 0.2 µL（2.5U），轻缓混匀。加 入 1µL 5.3.2 步骤中制备中的 cDNA，轻缓混匀，500g 离心 10 秒。置于 PCR 仪中先 94 ℃，3 min 进行预 变性，再按 94 ℃ 40 s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,运行 30 个循环,最后 72 ℃延伸 7 min。同时设立阳 性对照和阴性对照。 PCR 产物的检测：待 PCR 反应结束后，每个 PCR 管取 5 µL 反应液于