ICS 11.220 B 41 备案号：30887-2011 四 川 DB51 省 地 方 标 准 DB51/T 1284—2011 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范 2011- 06 - 27 发布 四川省质量技术监督局 2011 - 07 - 01 实施 发 布 DB51/T 1284—2011 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 ............................................................ 1 附录A（资料性附录） 培养基和试剂制备 ................................................ 4 I DB51/T 1284—2011 前 言 本标准附录A为资料性附录 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准由四川省动物疫病预防控制中心负责起草 本标准起草人：张焕容、余 勇、张 东、毛光琼、汤 李金海、罗 毅 承、岳 华、陈代平、郭 莉、吴 宣、 II DB51/T 1284—2011 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的分离鉴定方法。 本标准适用于鸡、鸭、鹅、野禽、猪、牛等多种畜禽空肠弯曲杆菌的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 空肠弯曲杆菌 Campylobacter jejuni 可致多种动物和人腹泻，在环境及健康动物体内广泛存在。菌体大小为 0.3 μm～0.4μm×1.5μm～ 3.0μm，弯曲杆状或海鸥展翅状，暴露于空气中后很快形成球状体，革兰氏染色阴性。 3.2 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction, PCR 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA 片段 3.3 引物 Primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条 DNA 模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条 DNA 模板链互补。 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 4.1 4.1.1 设备和材料 二氧化碳培养箱 4.1.2 微量移液器（0.1μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL、200μL～1000μL）及相应型号 的无菌吸头 1 DB51/T 1284—2011 4.1.3 微型离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.4 无菌工作台 4.1.5 接种环、接种针、酒精灯及酒精棉球 4.1.6 PCR 扩增仪及电泳仪 4.2 培养基和试剂（见附录 A） 4.2.1 改良 Skirrow 氏琼脂基础培养基（Skirrow Agar Base, Modified） 4.2.2 空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基（Campylobacter Agar Base） 4.2.3 Cary-Blair 氏运送培养基（Cary-Blair Transport Medium） 4.2.4 革兰氏染色液 4.2.5 TAE 缓冲液 4.2.6 琼脂糖及显色液 4.2.7 相关生化试剂 3％过氧化氢溶液、1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1%α-萘酚～乙醇溶液、甘氨 酸、醋酸铅培养基、马尿酸钠培养基、三氯化铁、萘啶酸、硝酸盐培养基、对氨基苯磺酸、醋酸、α奈胺、TTC 琼脂基础培养基。 4.2.8 PCR鉴定相关试剂 Taq DNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5mmol/L）、 2+ 10×PCR Buffer(无Mg )。 4.2.9 分离培养 4.2.10 用灭菌棉签无菌采集动物的泄殖腔（肛门）、空肠、盲肠内容物。 4.2.11 将采样棉签放入运送培养基带回实验室划线或直接划线于 Skirrow 氏培养基平板。 4.2.12 将该平板置于 42℃、10%二氧化碳的培养箱中培养 48h。 4.2.13 挑取疑似空肠弯曲杆菌的单个菌落（直径 1mm～2mm、透明、表面光滑），革兰氏染色镜检。 4.2.14 将革兰氏染色镜检疑似空肠弯曲杆菌的菌落接种于空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基平板上，置于 42℃、10%二氧化碳的培养箱中纯化培养 24h～48h。 4.2.15 在空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基平板上再挑取单个菌落革兰氏染色镜检，若含有其他杂菌，需 重复 4.3.5 继续纯化直到革兰氏染色镜检为弯曲杆菌为止。 4.3 4.3.1 细菌鉴定 细菌染色鉴定 - 革兰氏染色镜检为G 。 4.3.2 生化鉴定（ “+”为阳性反应，“-”为阴性反应） 触酶试验（+）、氧化酶试验（+）、甘氨 酸试验（+）、硫化氢试验（-）、马尿酸钠试验（+）、萘啶酸抑制试验（+）、硝酸盐还原试验（-） 和 TTC 试验（+）。 4.3.3 PCR 鉴定 2 DB51/T 1284—2011 4.3.3.1 PCR 引物 上游引物：5’-AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG-3’ 下游引物：5’-GAAGAGGGTTTGGGTGGTG-3’ 4.3.3.2 模板制备 细菌液体培养物 12000r/min 离心 20min， 弃上清，收集沉淀用于模板 DNA 提取。向上述沉淀中加 入 500 μL STE 缓冲液，使其重悬。加入 10%SDS 溶液 20μL，20mg/mL 蛋白酶 K10μL，混匀，在 56℃ 水浴 60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000r/min 离心 5min。转移上清到另 一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1） ，颠倒混匀，12000r/min 离心 5min。取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20℃沉淀 30min，12000r/min 离心 5min，弃去上清液。用 1mL 70%乙醇漂洗， 重复 2-3 次，12000r/min 离心 5min。室温干燥，DNA 沉淀用 25μL 无菌三蒸水溶解作为模板，-20℃保 存备用。 4.3.3.3 PCR 扩增 每次对检测样品进行 PCR 扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 2μL 、dNTP(2.5mM) PCR反应总反应体系 25μL，包括以下成份：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl（25mM） 2 2μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.2μL、上游引物（20μmol/L）1μL、下游引物（20μmol/L）1μL、水 14.3μL、 模板DNA（空白对照用水代替）2μL。 PCR 反应条件为 95℃ 预变性 5min，然后进行 95℃ 1min， 58℃ 1min， 72℃1min， 30 个循环， 最后 72℃ 延伸 10min，4℃保存。 4.3.3.4 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。取 5μL PCR 产物与 1μL 6 倍上样缓冲液混 合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系 统进行拍照。在阳性和空白对照成立的前提下，待检样品如果为阳性，则出现一条与阳性对照同步迁移 的目的条带。 4.3.3.5 结果判定 凡符合空肠弯曲杆菌的革兰氏染色特征、生化特性以及 PCR 鉴定呈阳性的菌株，均判为空肠弯曲杆 菌。 3 DB51/T 1284—2011 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基和试剂制备 A.1 试剂及制备 A.1.1 三氯化铁：FeCl3.6H2O 12g溶于2%盐酸溶液100mL即成。 A.1.2 氧化酶试剂 1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可 保存 2 周，若冰冻保存可用 4 周～6 周。 A.1.3 3%过氧化氢（H2O2） 30%过氧化氢 蒸馏水 装于棕色玻璃瓶中，有效期为一周。 A.1.4 10mL 90mL 1%甘氨酸培养基 布氏肉汤 1000 mL 琼脂 1.6 g 甘氨酸 10.0 g 将以上成分混合，加热溶解，校正PH7.0±0.2，分装13mm×100mm 试管，每支约4mL左右，121℃高 压灭菌15min，备用。 A.1.5 含30μg萘啶酸的圆形滤纸片。 A.1.6 快速硫化氢(H2S)试验琼脂 蛋白胨 15.0g 示胨 5.0g 牛肉浸粉 3.0g 酵母浸粉 3.0g 氯化钠 5.0g 硫酸亚铁 0.2g 硫代硫酸钠 0.3g 琼脂 4.0g 蒸馏水 1000ml pH 7.4 115℃高压蒸汽灭菌 15min，待冷却至 50℃～60℃，按 5%的比例加入灭活血清，分装于小试管中， 待凝固后，用于接种细菌。 A.1.7 STE缓冲液：0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)和1 mmol/L EDTA (pH8.0)。 4 DB51/T 1284—2011 A.1.8 TAE缓冲液 50×TAE电泳缓冲液贮存液：Tris碱 242g、EDTA 37.2g和冰乙酸 57.1mL混合， 加双蒸水至1000mL，应用前用双蒸水将50×TAE电泳缓冲液进行50倍稀释。 A.1.9 PCR鉴定相关试剂（10 × PCR Buffer 、6 ×loading buffer、 MgCl2、 dNTP、 Taq DNA 聚 合