DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB 41/T 873—2013 樱桃无病毒苗木繁育技术规范 Technical specification for propagatiom of virus-free seeding of cherry 2013 - 12 - 25 发布 河南省质量技术监督局 2014 - 02 - 25 实施 发 布 DB41/T 873—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国农业科学院郑州果树研究所提出。 本标准由河南省林业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所。 本标准主要起草人：赵改荣、李明、刘聪利、黄贞光、李玉红。 I DB41/T 873—2013 樱桃无病毒苗木繁育技术规范 本标准规定了樱桃无病毒苗木繁育技术的术语和定义、无病毒原种圃和母本圃的建立、无病毒苗木 繁育、病毒检测及监测、苗木出圃。 本标准适用于樱桃无病毒苗木的繁育。 1 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 5040 柑橘苗木产地检疫规程 GB/T 12943 苹果无病毒母本树和苗木检疫规程 NY/T 328 苹果无病毒苗木繁育规程 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 樱桃无病毒苗木 不携带李矮缩病毒(Prune dwarf virus, PDV)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus, PNRSV)、樱桃小果病毒（Little cherry virus, LChV）、樱桃绿环斑驳病毒（Cherry green ring mottle virus, CGRMV）、樱桃病毒A (Cherry virus A, CVA)、樱桃坏死锈斑病毒 (Cherry necrotic rusty mottle virus, CNRMV)、苹果褪绿叶斑病毒 (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)的樱桃苗木。 2.2 樱桃无病毒原种 经有资质的专业机构检测，确定不携带本标准规定病毒的原始植株。 2.3 樱桃无病毒母本圃 用于提供樱桃无病毒枝条、种子等繁殖材料的圃地。 3 无病毒原种圃的建立 3.1 脱毒材料母株要求 选取已经进入盛果期，经 3 年以上观察，品种纯正、生长健壮、外观无异常的植株作为待脱毒材料。 3.2 脱毒 1 DB41/T 873—2013 茎尖培养脱毒法参见附录 A，热处理脱毒法参见附录 B。待脱毒材料可直接经过病毒检测，筛选无 病毒材料。 3.3 无病毒原种的确定 应经有资质的检测机构检测认证，确定不带上述 7 种病毒后，即可作为无病毒原种进行保存。 3.4 无病毒原种保存 原种保存圃与普通果园或苗圃应相距 100 m 以上、搭建 300 目纱网网室，封闭覆盖全圃，出入口设 缓冲间。网室内土壤隔离覆盖。定植在花盆中，盆内土壤高温消毒，每个无病毒品种应保存 3 株以上， 每株编号、挂牌标识，绘制定植图。加强肥水管理，保证树势健壮。 无病毒原种圃常用工具要专用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用 70%酒精溶液消毒。工作人员进 入无病毒原种圃前更换工作服。 3.5 建立档案 建立樱桃无病毒原种保存圃档案。记载品种、砧木的中文名称、外文名称、品系、株系；引进单位、 来源、时间，脱毒、病毒检测的单位、时间及每年的观察记录等。 4 无病毒母本圃建立 4.1 无病毒母本圃圃地选择 母本圃地应选择未曾栽植过果树的地块。全圃封闭覆盖 300 目纱网，与普通果园或苗圃的距离应符 合 NY/T 328 的规定。 4.2 无病毒母本圃设计规划 建圃前按品种采穗圃、砧木采种圃和无性系砧木圃进行区划。设计好排灌系统、道路、建筑物等， 并进行土地平整、土壤改良和土壤消毒。 4.3 无病毒母本圃苗木来源 无病毒母本圃所采用的繁殖材料应全部直接来自樱桃无病毒原种保存圃。准确记载品种、砧木、原 母株株系；脱毒、病毒检测的单位、时间等。 4.4 无病毒母本圃定植 无病毒品种采穗圃和砧木采种圃株行距为 1 m～2 m×2 m～4 m；无性系砧木圃株行距为 0.5 m～ 1 m×2 m～3 m。按品种成行栽植，同一品种栽植在一起，定植后绘制定植图，做好标记，不得混杂。 每株母本树都要赋予唯一的编号。编号由品种名称、原种圃母株株系编号和本株的编号共同组成。按照 编号给每株母本树挂牌。 4.5 无病毒母本圃管理 4.5.1 加强母本圃肥水管理和病虫害防治，保证树势健壮，无早期落叶现象。 4.5.2 无病毒无性系砧木圃的树体，应每年短截更新，其方法与普通无性系砧木母株相同。不允许在 母本圃嫁接。 4.5.3 无病毒母本圃常用工具要专用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用 70%酒精溶液消毒。 2 DB41/T 873—2013 5 无病毒苗木繁育 5.1 苗圃建立 5.1.1 苗圃地选择 选择地势平坦，排灌方便，土壤肥沃，壤土、沙壤土质，土壤酸碱度适中，没有栽植过果树及果树 苗木的地方。苗圃与普通果园、苗圃的距离应符合 GB 5040 的规定，或全圃封闭覆盖 100 目防虫网、 与普通果园及苗圃距离应符合 GB/T 12943 的规定。 5.1.2 苗圃规划和建设 苗圃应划分为若干小区。规划出实生苗播种区、无性系砧木繁殖区、成苗培养区等。按规划设计出 各级道路、排灌系统，并统筹安排。平整土地，改良土壤，土壤消毒及增施有机肥。 5.2 实生砧木苗培育 砧木种子应采自无病毒母本圃。采种后标记其母株编号，并即刻沙藏，秋季或早春播种。播种前施 用杀菌剂和杀虫剂，进行土壤消毒。播种时按照母株编号分别播种，并绘制各株系分布图，田间插牌标 记，不得混杂。其他管理同普通苗圃。 5.3 无性系砧木苗培育 5.3.1 材料来源 无性系砧木繁殖材料，应来自无病毒母本圃。繁殖材料应分别挂牌标记其母株编号，按照品种及母 株编号分别繁殖。绘制各品种及株系分布图，田间插牌标记，不得混杂。 5.3.2 繁殖方法 5.3.2.1 压条、分株繁殖法 从无病毒母本圃植株上直接进行压条、分株繁殖的砧木自根苗，在苗圃栽植后再埋干压条繁殖无病 毒砧木苗。 5.3.2.2 组织培养法 组织培养方法繁殖砧木苗木，继代次数不超过 7 代。 5.3.2.3 扦插繁殖法 用绿枝扦插、硬枝扦插等方法繁殖无病毒砧木。 5.4 嫁接 5.4.1 接穗采集 接穗应采自无病毒母本圃。采集接穗的枝条生长健壮、芽体饱满、无落叶、无病害。采集的接穗应 在阴凉处立即剪去叶片。按品种扎成捆，挂牌标记母株编号。接穗存放同普通樱桃接穗。 5.4.2 嫁接 应分品种及不同母株分别嫁接。采用带木质部芽接法嫁接，嫁接位置距地面 10 cm～20 cm 处。嫁 3 DB41/T 873—2013 接后应按品种及母株编号分别记载。补接时，应与原来嫁接的接穗来源相同。 5.5 苗圃管理 加强土肥水管理与病虫害防治，保持苗木健壮生长、无早期落叶现象。 6 病毒检测及监测 6.1 病毒检测方法 6.1.1 木本指示植物检测法 李矮缩病毒、李属坏死环斑病毒、樱桃小果病毒、樱桃绿环斑驳病毒、樱桃坏死锈斑病毒、苹果褪 绿叶斑病毒可以采用木本指示植物检测法进行检测，操作步骤参见附录 C。 6.1.2 酶联免疫吸附检测法 能获得抗血清的樱桃病毒可以采用 A 蛋白酶联免疫吸附法（PAS-ELISA）进行检测，操作步骤参 见附录 D。 6.1.3 反转录-聚合酶链式反应检测法 李矮缩病毒、李属坏死环斑病毒、樱桃小果病毒、樱桃绿环斑驳病毒、樱桃病毒 A、樱桃坏死锈斑 病毒、苹果褪绿叶斑病毒均可以采用反转录-聚合酶链式反应检测法(RT-PCR)方法进行检测，操作步骤 参见附录 E。 6.2 无病毒原种的监测 无病毒原种圃的每株树，经常进行田间目测（参见附录 F），每年经 国家有资质的病毒检测单位进 行一次病毒检测，发现携带病毒植株，应连同容器立即清除。 6.3 无病毒母本圃的监测 在生长期，应每月对无病毒母本圃植株的表现症状进行全面的观察（参见附录 F），发现异常立即 检测。每 2 年对每株母本树进行一次病毒检测。发现带毒植株立即清除，并进行局部土壤消毒。 6.4 无病毒苗木监测 7.4.1 每年在生长季节对无病毒苗木进行两次全面观察，发现有病毒症状（参见附录 F），立即拔除 带毒植株及相邻植株。 7.4.2 每年苗木出圃前，应进行 1 次病毒检测，1‰抽检，随机取样。若检测出病毒，根据编号进行追 溯，对其母本树进行检测。若母本树带毒，应将带毒母本树繁殖的所有苗木及相邻苗木销毁或按普通苗 木处理；若母本树不带毒，将携带病毒苗木及相邻苗木销毁，或按普通苗木处理。 7 苗木出圃 7.1 苗木出圃时间 宜在苗木停止生长、叶片开始脱落至翌年春季萌芽前出圃。土壤上冻时不要挖苗。 7.2 苗木检疫 4 DB41/T 873—2013 挖苗前，应到县、区植物检疫站进行检疫，并办理检疫证书。 7.3 挖苗 在挖苗前一天把即将落叶的苗木叶片全部抹除（带叶栽植除外）。苗木主要根系要挖齐全，尽量减 少根系和苗干受伤。苗木挖好后，应及时分级、扎捆、挂标签和假植。 5 DB41/T 873—2013 A 附 录 A （资料性附录） 微茎尖培养法脱毒技术 A.1 早春，从预选的植株上随机切取刚萌动变绿尚未展叶的饱满芽，或 3～5 月剪取抽生的嫩茎尖，去 叶后作为外植体。 A.2 用洗涤剂水浸 3 min 后，流水冲洗 10 min，转入超净工作台上，70%酒精浸泡 6 s，2%次氯酸钠灭 菌 10 min～20 min，无菌水冲洗 3 次。 A.3 解剖镜放置在超净台上，用棉球蘸消毒酒精擦拭手及台面，点燃酒精灯，将大小镊子灼烧消毒。 将铺有无菌滤纸的无菌培养皿放置在解剖镜台上，用镊子取出 A.1 切取的材料，利用解剖针在解剖镜下 剥除其外部叶原基，切取 1.0 mm 以下茎尖分生组织(带 1～2 片叶原基)，用无菌滤纸吸干水。 A.4 将外植体接种于接种培养基（表 A.1、表 A.2）上，25 ℃恒温培养，每天光照 2000 lx～3000 lx 14 h，黑暗 10 h，诱导丛生芽。 表 A.1 MS 培养基配方 单位为毫克/升 类型 大量元素 成分 硝酸钾 KNO3 1900 硝酸铵 NH4NO3 1650 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 硫酸镁 MgSO4·7H2O 370 氯化钙 CaCl2·2H2O 440 乙二胺四乙酸二钠 铁盐 硫酸亚铁 碘化钾 FeSO4·7H2O 6.2 硫酸