ICS 65.020 B 05 备案号：35077-2012 吉 林 DB 22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1589—2012 高粱品种鉴定 DNA 指纹法（SSR） Identification of sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) varieties using DNA fingerprinting method (SSR) 2012 - 09 - 15 发布 吉林省质量技术监督局 2012 - 10 - 31 实施 发 布 DB22/T 1589—2012 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院农业部植物新品种测试(公主岭)分中心、农业生物技术研究所。 本标准主要起草人：李晓辉，王凤华，张春宵，周海涛，郝彩环，王威，侯佳明，王晶。 I DB22/T 1589—2012 高粱品种鉴定 DNA 指纹法（SSR） 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（SSR,simple sequence repeat）分子标记进行高粱 (Sorghum bicolor (L.) Moench)品种DNA指纹鉴定的试验方法、数据采集、结果记录及判定标准。 本标准适用于高粱各类材料的DNA分子数据采集和品种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核心引物 core primer 多态性、稳定性、重复性等综合特性好，可作为DNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，包括基本核 心引物和扩展核心引物。基本核心引物是用于品种建库和鉴定，并且保证不同实验室数据具有可比性， 可进行数据整合的一套统一固定引物。扩展核心引物是可根据引物的最新研究结果和特殊鉴定性状进行 调整的一套相对固定的引物。 3.2 参照品种 reference cultivar 用于确定等位变异，校正仪器设备的系统误差,对应于特定SSR位点上大小已知的不同等位变异的一 组品种。 4 原理 从高粱种子、幼苗、叶片等组织中提取DNA，利用普通或荧光染料标记的SSR引物进行PCR扩增。 不同长度的PCR扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分 开来。不同高粱品种由于遗传组成不同，在基因组DNA的多个SSR位点中，一些位点的简单重复序列的 重复次数有差异，这种差异可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区分，从而对不同品种进行区分鉴定。 1 DB22/T 1589—2012 5 试剂与材料 除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB: C16H33(CH3)3 NBr）。 5.1.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O: C10H14N2Na2O8·2H2O）。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（tris-base: C4H11NO3）。 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 5.1.10 5.1.11 5.1.12 5.1.13 氢氧化钠（NaOH）。 氯化钠（NaCl）。 琼脂糖（agarose）。 溴酚蓝（brph blue: C19H10Br 4O5S）。 二甲苯青 FF（C25H27N2O6S2Na）。 甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide: (H2C=CHCONH)2CH2）。 丙烯酰胺（C3H5NO）。 硼酸（boric Acid: H3BO3）。 尿素（CH4N 2O）。 过硫酸铵（APS: (NH4)2S2O8）。 5.1.14 5.1.15 5.1.16 5.1.17 5.1.18 5.1.19 5.1.20 5.1.21 5.1.22 5.1.23 乙酸铵（CH3COONH4）。 硝酸银（AgNO3）。 三氯甲烷（CHCl3）。 异丙醇（C3H8O）。 异戊醇（C5H12O）。 盐酸（HCl）：37%。 10×Buffer 缓冲液: 含 Mg2+ 25 mmol/L。 四种脱氧核苷三磷酸: dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10 mmol/L each）。 Taq DNA 聚合酶：2 U/mL。 矿物油。 5.1.24 5.1.25 5.1.26 5.1.27 5.1.28 5.1.29 5.1.30 5.1.31 5.1.32 5.1.33 去离子甲酰胺（formamide: HCONH）。 亲和硅烷（binding silane）: 97%。 剥离硅烷（repel silane）: 2%二甲基二氯硅烷（C2 H6Cl2Si）。 无水乙醇（C2H6O）。 四甲基乙二胺（TEMED: C6H16N2）。 冰醋酸（C2H4O2）。 甲醛溶液（CH2O）: 37%。 DNA 分子量标准: DL2000。 核酸染色剂。 DNA 分析仪专用丙烯酰胺胶液。 5.1.34 DNA 分析仪专用电泳缓冲液。 5.1.35 DNA 分析仪专用分子量内标 Liz 标记。 5.1.36 DNA 分析仪专用光谱校准基质，6-FAM 荧光标记的 DNA 片段。 5.2 试剂配制 2 DB22/T 1589—2012 5.2.1 DNA 提取试剂的配制 5.2.1.1 EDTA 溶液（0.5 mol/L） 186.1 g EDTA -Na2·2H2O溶于800 mL水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000 mL，103.4 kPa灭菌。 5.2.1.2 Tris-HCl 溶液（1 mol/L） 60.55 g Tris-base溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500 mL，103.4 kPa灭菌。 5.2.1.3 HCl 溶液（0.5 mol/L） 25 mL浓盐酸(36%-38%)，加水定容至500 mL。 5.2.1.4 NaCl 溶液（5 mol/L） 292.5 g NaCl + ddH2O至终体积1000 mL，103.4 kPa灭菌。 5.2.1.5 DNA 提取 CTAB 缓冲液 1 mol/L Tris-HCl 83.5 mL，5 mol/L NaCL 235 mL，0.5 mol/L EDTA 33.4 mL，CTAB固体20 g，定容 至1000 mL。 5.2.1.6 氯仿-异戊醇(24:1) 按24:1的比例（体积比）配制混合液。 5.2.1.7 76%乙醇 无水乙醇380 mL，定容至500 mL。 5.2.1.8 TE 缓冲液 1 mol/L Tris-HCl 5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，加HCl调pH至8.0，定容至500 mL。 5.2.2 dNTP 的配制 用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100 mmol/L的储存液。各取20 μL混合，用超纯水120 μL定容 至每种核苷三磷酸终浓度为10 mmol/L的工作液。103.4 kPa灭菌，-20 ℃保存。 5.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制 5.2.3.1 40% PAGE 胶 190 g丙烯酰胺和10 g甲叉双丙烯酰胺，定容至500 mL，混匀。4 ℃贮存备用。 5.2.3.2 6% PAGE 胶 尿素450 g，10×BTE缓冲液100 mL，40%PAGE胶150 mL，定容至1000 mL。 5.2.3.3 亲和硅烷工作液 250 μL冰醋酸，250 μL亲和硅烷，加无水乙醇至50 mL，混匀。分装于1.5 mL Eppendorf管中。4℃ 贮存备用。 5.2.3.4 剥离硅烷工作液 3 DB22/T 1589—2012 2%二甲基二氯硅烷。 5.2.3.5 25%过硫酸铵溶液 0.25 g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中，混匀。 5.2.3.6 10×TBE 缓冲液 Tris-base 108 g，硼酸 55 g，EDTA-Na2·2H2O 7.44 g，定容至1 L。 5.2.3.7 1×TBE 缓冲液 10×TBE缓冲液500 mL，加水定容至5 L。 5.2.3.8 6×加样缓冲液 去离子甲酰胺（用于DNA变性）49 mL，0.5 mmol/L EDTA 1 mL，溴酚兰0.125 g，二甲苯青0.125 g。 5.2.4 银染试剂的配制 5.2.4.1 固定液 200 mL冰醋酸，加水定容至2000 mL。 5.2.4.2 染色液 3 g硝酸银，加水定容至2000 mL。 5.2.4.3 显影液 2000 mL蒸馏水中加入25 g氢氧化钠和7 mL甲醛。 注1：银染溶液的配制可使用符合 GB/T 6682 规定的三级水。 注2：同样标准的试剂盒可代替上述试剂。 6 仪器设备 6.1 异。 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 DNA 分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨 1 个核苷酸大小的差 紫外分光光度计：波长 260 nm 及 280 nm。 酸度计。 电子天平：感应为 0.01 g、0.001 g。 凝胶成像系统或紫外透射仪。 PCR 扩增仪。 高压电泳仪：规格为 3000 V、400 mA、400 W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。 垂直电泳槽及配套的制胶附件。 6.9 普通电泳仪。 6.10 水平电泳槽及配套的制胶附件。 6.11 高速冷冻离心机：最大离心力不小于 15,000 rpm。 6.12 水平摇床。 6.13 胶片观察灯。 4 DB22/T 1589—2012 微量移液器：规格分别为 10 mL、20 mL、100 mL、200 mL、1000 mL，连续可调。 磁力搅拌器。 微波炉。 高压灭菌锅。 水浴锅或金属浴：控温精度±1 ℃。 冰箱：最低温度-20 ℃。 制冰机。 6.14 6.15 6.16 6.17 6.18 6.19 6.20 7 SSR 引物 用超纯水分别配制正向引物和反向引物终浓度均为20 μmol/L，等体积混合成10 μmol/L的工作液。 引物在DNA分析仪上使用时，须在正向引物5′端加入6-FAM荧光修饰基团。引物清单见