ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1313—2013 流行性感冒病毒快速筛查方法 酶联免疫渗滤法 Rapid screening test of influenza virus Enzyme-linked Immunofiltration Assay 2013 - 02 -20 发布 福建省质量技术监督局 2013 - 05 - 20 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 流行性感冒病毒快速筛查方法 —酶联免疫渗滤法 DB35/T 1313—2013 * 2013 年 2 月第一版 2013 年 2 月第一次印刷 DB35/T 1313—2013 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国厦门出入境检验检验局提出。 本标准由福建省质量技术监督局归口。 本标准负责起草单位：厦门国际旅行卫生保健中心、厦门大学公共卫生学院。 本标准主要起草人：杨坤宇、张毅、李庶甘、陈帆、林青、陈慧、陈毅歆、葛胜祥、杨剑。 I DB35/T 1313—2013 流行性感冒病毒快速筛查方法—酶联免疫渗滤法 1 范围 本标准规定了流行性感冒病毒快速筛查方法的术语和定义、生物安全防护要求、样本采集与处理、 检测步骤与结果判定。 本标准适用于人体感染甲型流感病毒或乙型流感病毒的快速筛查方法--酶联免疫渗滤法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 SN/T 2752.1-2011 卫生检疫人员的自我防护规范 第1部分：传染病 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 流行性感冒 influenza 由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触、被污染物品的 接触传播。典型的临床症状为迅速发热、浑身酸痛、乏力等。流感病毒归属于正粘病毒科 （Orthomyxoviridae），是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，根据病毒核蛋白（NP）和基 质蛋白（M）抗原性的差异，将流感病毒分为甲、乙和丙三型，乙型和丙型只能感染人，而甲型可以感 染禽类、人和猫等哺乳动物，根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，又可将甲型 流感病毒分成16个H和9个N亚型。 4 方法原理 酶联免疫渗滤法采用酶联免疫原理中的双抗体夹心法和免疫渗滤技术制备而成，用于检测样本中的 甲型或乙型流感病毒核蛋白NP抗原。在硝酸纤维膜上包被抗NP抗原的单克隆抗体，待测样本经裂解液处 理后，被硝酸纤维膜上的单克隆抗体捕获，形成抗原-抗体复合物，再加入抗NP抗原的酶标抗体，形成 抗体-抗原-酶标抗体复合物，最后通过酶催化底物显色进行结果判定。 5 生物安全防护要求 现场采样人员的个人防护应符合SN/T 2752.1-2011的要求，实验室结构和设施、安全操作规范、安 全设备、实验人员防护及废弃物品处理应符合GB 19489-2008中二级生物安全防护实验室的要求。 1 DB35/T 1313—2012 6 仪器和材料 6.1 仪器和设备 ——振荡器。 ——可调式微量加样器。 ——普通冰箱（2℃～8℃）、超低温冰箱（-70℃）。 6.2 耗材 ——压舌板。 ——医用微生物拭子。 ——与可调式微量加样器配套使用的滤芯吸头。 ——样本处理瓶（能装 2mL 液体的尖嘴塑料过滤瓶）。 6.3 试剂和溶液 除另有说明外，所用试剂不低于分析纯，所用的水为去离子水。 6.3.1 样本保存液 甲液：Na2HPO4•2H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，MgSO4•7H2O 0.2g，Glucose 1.0g，NaCl 8.0g，水750mL。 乙液：CaCl2 0.14g，水100mL。 样本保存液：将乙液缓慢加入甲液中，形成A液。在36℃～38℃条件下，将0.35g NaHCO3溶解在100mL 水中，形成B液。取3mL～5mL的B液，溶入0.02克酚红，形成C液。将上述三种液体混合在一起，再用水 定容至1000mL，充分混匀，过滤，消毒灭菌。 6.3.2 裂解液 将15g十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、58.5g NaCl、30mL0.5 mol/L乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)溶解至600mL的水中，加入75mL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），用水定容至1000mL。 6.3.3 反应板 用抗重组甲型流感病毒NP蛋白的单克隆抗体或抗重组乙型流感病毒NP蛋白的单克隆抗体包被反应 孔，每孔100ng。 6.3.4 质控点 包被羊抗鼠或兔抗鼠等多克隆抗体，每孔 50 ng。 6.3.5 酶标试剂 标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗重组甲型流感病毒 NP 蛋白的单克隆抗体或抗重组乙型流感病毒 NP 蛋白的单克隆抗体。 注：用于制备酶标试剂的单克隆抗体所对应的病毒抗原位点应与用于包被反应板的单克隆抗体所对应的位点不同。 6.3.6 2 洗涤液 DB35/T 1313—2013 PBST（20mmol/L NaCl, 2.68mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, 1.76mmol/L KH2PO4, 0.05%Tween-20 ）。 使用时用水稀释20倍。 6.3.7 显色液 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine ，TMB）膜底物显色液。 6.3.8 终止液 2mol/L H2SO4。 7 样本采集与处理 7.1 样本采集 7.1.1 鼻咽拭子样本的采集 使用医用微生物拭子采集人鼻咽部样本，轻轻转动并推动拭子，使微生物拭子头部深入鼻腔根部， 轻转几圈以获得病毒丰度较高的鼻咽拭子样本。将拭子折断，弃去手接触部分，将带有医用棉签的部分 浸泡至1mL～2mL的样本保存液中。在样本保存管上标注被采集人员姓名、采集时间和样品编号。 7.1.2 咽拭子样本的采集 嘱受采集人员发“啊”音，必要时以压舌板轻压舌部，迅速用医用微生物拭子擦拭两侧腭弓及咽、 扁桃体的分泌物。将拭子折断，弃去手接触部分，将带有医用棉签的部分浸泡至1mL～2mL的样本保存液 中。在样本保存管上标注被采集人员姓名、采集时间和样品编号。 7.2 样本转运 采集的样本，在冷藏条件下（2℃～8℃）由专人运送至实验室。 7.3 样本保存 样本在3天内检测，可贮存于2℃～8℃的冰箱内；若在3天以后检测，须保存于-70℃以下的超低温 冰箱内，并应避免反复冻融。 8 操作步骤 本操作步骤以已经上市的甲型流感病毒抗原快速检测试剂盒（产品标准编号：YZB/国1727-2009） 为例（给出这一信息是为了方便本标准的使用者），也可以采用其他等效市售商品试剂盒，但应严格按 试剂盒说明书要求进行操作。 8.1 样本前处理 使用前将样本平衡约15 min至室温后，用振荡器振荡，混匀，待测。 8.2 裂解 将200 µL待测样本置于样本处理瓶中，加入400 µL裂解液，将瓶盖拧紧，充分混匀。 8.3 加样 3 DB35/T 1313—2012 拧开样本处理瓶滴头盖，倒置样本处理瓶并用力挤瓶壁使瓶中样本尽可能多地滴入反应板中，待样 本完全渗入后（约10 min），摘掉反应盖。 8.4 加酶 在反应孔中加入200 µL的酶标试剂，待酶标试剂完全渗入后再等待2 min～3 min。 8.5 洗涤 在反应孔中加入350 µL的洗涤液，待液体完全渗入后再加入350 µL的洗涤液。 8.6 显色 待洗涤液完全渗入后，在反应孔中加入100µL显色液，完全渗入后再反应2min～3min。 8.7 终止 在反应孔中加入50 µL终止液，3 min内观察结果。 9 结果判定 通过肉眼观察质控点和检测点的颜色变化判定结果（如图1）。 ——质控点（C）显色，检测点(T)不显色，结果判定为阴性（如 a)阴性图形）； ——质控点（C）显色，检测点(T)也显色，结果判定为阳性（如 b)阳性图形）； ——质控点（C）不显色，无论检测点（T）显色或不显色，结果均判定为无效（如 c)无效图形）。 质控点(C) 检测点(T) a a) 阴性图形 图1 b c b) 阳性图形 c) 无效图形 免疫渗滤法检测流感病毒抗原的结果示意图 _________________________________ 4