ICS 11.120.10 C 15 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1514—2015 农产品中白藜芦醇的测定 高效液相色谱法 Determination of resveratrol in agricultural products High performance liquid chromatography method 2015-06-26 发布 福建省质量技术监督局 2015-09-26 实施 发 布 DB35/T 1514—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农科院中心实验室 本标准主要起草人：潘葳、涂杰峰、刘文静、罗钦。 I DB35/T 1514—2015 农产品中白藜芦醇的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了农产品中白藜芦醇含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于花生衣、葡萄皮、苜蓿、虎杖、藜芦等农产品中白藜芦醇含量的测定。 本标准方法测定花生衣、葡萄皮、苜蓿中白藜芦醇含量的检出限均为0.6 μg/g，定量限均为2.0 μg/g； 虎杖、藜芦中白藜芦醇含量的检出限均为7.5 μg/g，定量限均为25 μg/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 用乙醇-水溶液提取试样中的白藜芦醇，提取液离心后，取上清液，经微孔滤膜过滤，高效液相色 谱-紫外检测法测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682-2008中一级要求。 4.1 无水乙醇（C2H6O）。 4.2 甲醇（CH4O）：色谱纯。 4.3 乙腈（C2H3N）：色谱纯。 4.4 冰醋酸（C2H4O2）。 4.5 85%乙醇溶液：取 850 mL 无水乙醇（4.1），加 150 mL 水，混匀。 4.6 白藜芦醇标准品（CAS 501-36-0，反式）：纯度≥99%（质量分数）。 4.7 0.1%乙酸溶液：取 1.0 mL 冰醋酸（4.4），用水稀释并定容至 1000 mL。 4.8 流动相：将 26 体积乙腈（4.3）与 74 体积 0.1%乙酸溶液（4.7）混合。使用前经微孔滤膜（5.9） 过滤并脱气。 4.9 白藜芦醇标准储备液（500 μg/mL）：称取 50 mg（精确至 0.1 mg）白藜芦醇标准品（4.6），置于 100 mL 容量瓶（5.11）中，用甲醇（4.2）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 500 μg/mL 的标准储备液， 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 2 个月。 4.10 白藜芦醇标准工作液：分别准确移取 0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL 白藜芦醇标准 储备溶液（4.9）于不同的 50 mL 容量瓶（5.11）中，用流动相溶液（4.8）稀释并定容至刻度，摇匀， 得到不同浓度的白藜芦醇标准工作溶液（质量浓度分别为 0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、 10 μg/mL），即配即用。 1 DB35/T 1514—2015 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 电子天平：感量 0.1 mg。 电热鼓风干燥箱：温度可控制。 粉碎机：高速万能粉碎机，转速 24 000 r/min，或相当的设备。 涡旋振荡器。 超声波清洗器：功率不低于 250 W，或相当的设备。 离心机型号 1：体积 50 mL，转速不低于 4 000 r/min 或相当的设备； 离心机型号 2：体积 2 mL，转速不低于 10 000 r/min 或相当的设备。 微孔滤膜：0.22 μm，直径 25 mm 的聚砜膜或相当者。 离心管：50 mL（螺旋盖），1 mL。 容量瓶：100 mL、50 mL（棕色）。 分样筛：筛网孔径为 250 μm。 分析步骤 以下操作尽可能避免阳光直射。 6.1 样品前处理 6.1.1 试样制备 将花生衣、葡萄皮、苜蓿、虎杖、藜芦等样品置于干燥箱（5.3）中，60 ℃恒温干燥至恒重，冷却 至室温后，分取样品约100 g，用粉碎机（5.4）粉碎，过分样筛（5.12），备用。 6.1.2 提取 称取花生衣、葡萄皮、苜蓿等粉碎样品约 2.5 g（精确到 0.1 mg）；虎杖、藜芦等粉碎样品约 0.2 g （精确到 0.1 mg）于 50 mL 离心管（5.10）中，加入 30 mL 85%乙醇溶液（4.5），涡旋振荡器（5.5） 涡旋振荡 2 min，旋紧盖子，用超声波清洗器（5.6）超声波萃取 15 min，萃取功率为 250 W，用离心机 （5.7）4 000 r/min 离心 10 min，将上层溶液移入 50 mL 容量瓶（5.11）中。再分 2 次各用 10 mL 85% 乙醇溶液（4.5）重复以上振荡、萃取和离心步骤，合并提取液于 50 mL 容量瓶（5.11）中，用 85%乙 醇溶液（4.5）定容至刻度，摇匀。移取 1 mL 定容液，用离心机（5.8）10 000 r/min 离心 10 min，离心 后的上清液经微孔滤膜（5.9）过滤，滤液待上机测定（72 h 内完成测定）。 6.2 样品测定 6.2.1 高效液相色谱参考条件 以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性： ——色谱柱：C18，150 mm×4.6 mm i.d.，粒径3 μm，或性能相当者； ——柱温：40 ℃； ——紫外检测波长：306 nm； ——流速：1.0 mL/min； ——进样体积：10 μL。 2 DB35/T 1514—2015 6.2.2 液相色谱测定 分别取适量的白藜芦醇标准工作溶液（4.10）及待测样液，按 6.2.1 列出的条件进行液相色谱分析 测定。由保留时间进行定性，外标法定量，根据标准工作溶液的浓度及白藜芦醇响应峰面积，建立标准 工作曲线。工作曲线线性相关系数 R2≥0.99。 待测样液中白藜芦醇的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析间 每 20 次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超 过 5%，则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录 A。 7 结果计算与表示 7.1 结果计算 试样中白藜芦醇的含量按式（1）进行计算： X  c V  f ..................................... (1) m 式中： X——试样中白藜芦醇的含量（以质量分数计），单位为微克每克（μg/g）； c——由标准工作曲线得出的白藜芦醇浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； f ——试样稀释倍数； m——试样质量，单位为克（g）。 7.2 结果表示 测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。在重复条件下获得的两次独 立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 8 精密度和回收率 本标准的精密度与回收率试验结果参见附录 B。 9 检验报告 检验报告应包括以下内容： ——识别被测试样需要的所有信息； ——依据本标准方法； ——白藜芦醇的测定结果； ——实验日期； ——测定人员。 此外，还需说明使用的方法，还应包括本标准未规定的或选择性的条件，以及可能影响结果的其它 条件。测试报告应包括试样的唯一性资料。 3 DB35/T 1514—2015 AA 附 录 A （资料性附录） 色谱图示例 标准溶液及典型样品色谱图示例分别见图A.1～图A.6。 图A.1 图A.2 4 标准溶液色谱图 花生衣试样色谱图 DB35/T 1514—2015 图A.3 图A.4 葡萄皮试样色谱图 苜蓿试样色谱图 5 DB35/T 1514—2015 6 图A.5 虎杖试样色谱图 图A.6 藜芦试样色谱图 DB35/T 1514—2015 BB 附 录 B （资料性附录） 精密度和回收率试验研究结果 本方法的精密度和回收率研究结果见表B.1。 表B.1 方法的精密度与回收率 样品 RSD% (n=6) 平均回收率% 日内 日间 低 中 高 花生衣 4.9 4.8 95.1 96.7 97.6 葡萄皮 3.7 4.3 97.1 99.7 96.8 苜蓿 4.5 4.6 91.6 98.6 97.4 虎杖 1.7 3.3 98.9 99.5 96.6 藜芦 1.9 3.2 97.9 98.0 97.7 _________________________________ 7 DB35/T 1514－2015 福 建 省 地 方 标 准 农产品中白藜芦醇的测定 高效液相色谱法 DB35/T 1514—2015 * 2015 年 11 月第一版 2015 年 11 月第一次印刷