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ICS11.020 C 05 S 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 5942018 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱 酯酶等位基因检测法 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele intheMuscadomestica 行业标准信息服务平台 2018-03-01发布 2018-08-01实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T5942018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准主要起草单位:中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预 防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行 病研究所、上海市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人:邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷 培恩。 行业标准信息服务平台 I WS/T5942018 蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。 本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶 每acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶,由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。 2. 2 等位基因allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。 2. 3 342G、342V和342A 342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸(G1y)、 缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala) 3 3样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内,浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在 4℃条件下短期(6个月内)保存,可在-20℃以下长期保存。 4引物 引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC,引物R的序列为CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附 录A。配制为10umo1/L浓度,保存于-20℃冰柜。 5仪器设备 5.1PCR(聚合酶链式反应)仪。 5.2琼脂糖凝胶电泳仪。 1 WS/T5942018 5.3凝胶成像仪。 5.4恒温水浴锅。 6主要试剂 6.1DNA聚合酶(Taq酶)。 6.2限制性内切酶Bsp1286l。 6.3限制性内切酶Eael。 7操作步骤 7.1在PCR管中加入10×PCR缓冲液(含100mmo1/LTris-HC1,500mmol/LKC1,15mmo1/LMgC12) 2.5μL,dNTP(2.5mmo1/L)2.0μL,引物F0.5μL,引物R0.5μL,单头家蝇的基因组DNA1μL (100ng~300ng,提取方法可参见附录B,也可用商售的DNA提取试剂盒或其他类似方法提取)和Taq 酶(2~5个单位),用灭菌水补齐至25μL,混匀。 7.2将PCR管放入PCR仪中,设置PCR反应程序为:94℃3min;94℃30S,50℃30S,72℃ 30s,35个循环;72℃10min。运行程序。 7.3PCR运行结束后,取5μLPCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,电压设定在160V,电泳 20min后在紫外光下检测,有清楚单一的609bp的条带的PCR产物用于进行以下酶切反应。 7.4取合格样品(即电泳检测产物为609bp)的PCR产物设置两个酶切反应,反应A用Bsp1286I酶、 反应B用EaeI酶进行酶切,酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行(参见附录C)。 7.5将酶切后的产物上样在1.5%的琼脂糖凝胶上,电压设定在160V,电泳20min后在紫外光下检 测。 8基因型确定 根据酶切产物的电泳结果(参见附录D),确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型,见表1。 表1家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应I(加Bsp1286I酶切) 反应II (加EaeI酶切) 乙酰胆碱酯酶342氨基酸位点基因型 361bp、248bp 609bp 敏感型纯合子(G/G) 609bp 609bp 不敏感I型纯合子(V/V) 609bp 361bp、248bp 不敏感II型纯合子(A/A) 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感1型/敏感型杂合子(G/V) 609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感II型/敏感型杂合子(G/A) 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感I型/不敏感II型杂合子(V/A) 注:G表示氨基酸残基为Gly(甘氨酸);V表示氨基酸残基为Val(缬氨酸):A表示氨基酸残基为Aal(丙 氨酸)。 2
WS-T 594-2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇 不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法
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