(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210694792.1 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 刘萍 地址 044100 山西省运城市临猗县猗氏镇 兴教坊村二组 (72)发明人 刘萍　 (74)专利代理 机构 广州蓝晟专利代理事务所 (普通合伙) 44452 专利代理师 高学敏 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 13/00(2006.01) C12M 3/00(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12M 1/26(2006.01)C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种干细胞外泌体的提取方法 (57)摘要 本发明提供了一种干细胞外泌体的提取方 法， 属于细胞提取技术领域， 用于解决现有干细 胞外泌体提取效率低和纯度低的技术问题。 本方 法先对干细胞进行两次无菌培养， 获取较为纯净 且外泌体含量较高的提取液； 再进行两次除杂处 理， 能够有效去除杂质和囊泡， 保证外泌体的纯 度； 再进行筛选处理， 能够将残留的细胞、 血小板 和稍大的胞外囊膜去除， 进一步提高纯度； 再对 外泌体进行孵育； 最后通过低速离心回收外泌 体， 得到高纯度的干细胞外泌体。 在除杂后对提 取液进行筛选纯化处理， 提高了外泌体的纯度， 纯化后的提取液采用PEG溶液孵育后进行低速离 心沉淀即可获取干细胞外泌体， 操作方便， 耗时 短， 提高了干细胞外泌体的提取效率和纯度， 适 合批量化提取。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114958721 A 2022.08.30 CN 114958721 A 1.一种干细胞外泌体的提取 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一， 干细胞的一 次无菌培养： 采用含血清的培养基在恒温无菌环境中培养干细胞， 培养一定时间后， 提取干细胞； 步骤二， 干细胞的二次无菌培养： 对提取的干细胞采用不含血清的培养基在恒温无菌 环境中培 养一定时间， 提取培 养上清液； 步骤三， 一 次除杂处理： 将步骤二中得到的培养上清液进行第一 次离心处理， 提取上清 液， 能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎片； 步骤四， 二次除杂处理： 对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理， 提取上清液， 能够去除较大的囊泡； 步骤五， 筛选处理： 采用细胞分选装置对步骤四得到的上清液进行筛分， 将其中残留的 细胞、 血小板和稍大的胞外囊膜去除， 得到含有外泌体的纯化 提取液； 步骤六， 外泌体孵育： 将步骤五种获取的提取液采用PEG溶液混合在4℃无菌恒温条件 下孵育； 步骤七， 外泌体提取： 将孵育后的提取液通过低速离心即可沉淀回收外泌体， 得到高纯 度的干细胞外泌体。 2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤一中干 细胞的一次无菌 培养时间为(15 ‑18)h。 3.根据权利要求2所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤二中干 细胞的二次无菌 培养时间为(18 ‑24)h。 4.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤三中上 清液的第一次离心处 理， 采用3 00g离心力， 离心处 理(8‑10)min。 5.根据权利要求5所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤四中上 清液的第二次离心处 理， 采用20 00g离心力， 离心处 理(8‑10)min。 6.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤五筛选 处理， 采用两个串联 的细胞分选装置进行筛分对提取液进行纯化， 细胞分选装置由一个微 流体通道和两端的声换能器组成， 第一个细胞分选装置的声波频率较低， 用来去除样本中 残留的细胞和血小板， 第二个细胞分选装置的声波频率较高， 将样本中的外泌体与稍大 的 胞外囊膜分离开 来， 得到含有外泌体的纯化 提取液。 7.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤六中 PEG溶液的浓度为0.25g/ml， PEG溶液的配制方法为： 按照0.25g/ml的浓度比例， 称取 PEG8000溶解于Milli ‑Q超纯水中， 121℃条件下湿热灭菌30min； 获取的PEG溶液保存在4℃ 的恒温无菌环境中。 8.根据权利要求7所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤六中外 泌体孵育的时间为(8 ‑10)h。 9.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述步骤七中外 泌体提取的离心条件为： 5 00g离心力， 离心处 理(8‑10)min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958721 A 2一种干细胞外泌体的提取方 法 技术领域 [0001]本发明属于细胞提取技 术领域， 涉及一种干细胞外泌体的提取 方法。 背景技术 [0002]干细胞外泌体是来自干细胞的一种细胞分泌物， 外泌体是干细胞分泌微小的囊泡 (宽30至150纳米)， 它带上有干细胞的蛋 白、 mRNA和microRNA等生物活性化学物质， 具备干 细胞的一些功能。 外泌体合乎纳米颗粒的界定， 干细胞外泌体可以透过血脑屏障， 是干细胞 与别的细胞中间信息内容传送的关键物质， 有利于干细胞功能的完成。 它们类似细胞间的 “通信兵”可以在细胞之间转移DNA， RNA或蛋白质， 从而影 响受体细胞的功能， 在干细胞和再 生医学领域， 外泌体正在被用于以治疗从心脏病到呼吸系统疾病的疾病。 [0003]干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能， 但干细胞外泌体更加安全稳定高 效， 外泌体对受损的微环境不响应， 具有 更强而复杂的信号分子转运和调控能力， 具有改变 细胞外基质， 改变受体细胞的转录组和蛋白质组， 调节细胞凋亡， 生长， 增殖和分化途径的 能力。 外泌体中包含多种生物因子， 这些因子被发现可诱导成纤维细胞的迁移和增殖以及 胶原的合 成； 具有减少细胞凋亡、 减轻炎症反应、 促进 血管生成、 抑制纤维化、 提高组织修复 潜力等重要生物学功能， 在组织损伤 修复、 慢性伤口愈合、 抑制伤口瘢痕形成及抗衰 老等方 面具有良好的应用前 景。 而获得高纯度的干细胞外泌体展开应用研究的前提。 [0004]目前， 干细胞外泌体的分离提取常用的有离心法、 色谱法、 密度梯度离心法和磁珠 免疫法； 色谱法存在难易大规模生产、 效率低的问题； 密度梯度离心法由于操作比较复杂、 耗时， 同样不适合进 行大规模生产； 而基于超速离心的外泌体分离方法存在产量和纯度低、 膜完整性损失且耗时长等问题； 磁珠免疫法是效率低， 外泌体生物活性易受pH和盐浓度影 响， 不利于下游实验， 难以广泛 普及。 [0005]基于此， 提出一种能够提高纯度高和提取效率的干细胞外泌体提取 方法。 发明内容 [0006]本发明的目的是针对现有的技术存在上述问题， 提出了一种干细胞外泌体的提取 方法， 本发明要解决的技 术问题是： 如何干细胞外泌体的纯度高和提取效率。 [0007]本发明的目的可通过 下列技术方案来实现： [0008]一种干细胞外泌体的提取 方法， 干细胞外泌体的提取步骤如下： [0009]步骤一， 干细胞的一次无菌培养： 采用含血清的培养基在恒温无菌环境中培养干 细胞， 培养一定时间后， 提取干细胞； [0010]步骤二， 干细胞的二次无菌培养： 对提取的干细胞采用不含血清的培养基在恒温 无菌环境中培 养一定时间， 提取培 养上清液； [0011]步骤三， 一次除杂处理： 将步骤二中得到的培养上清液进行第一次离心处理， 提取 上清液， 能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎片； [0012]步骤四， 二次除杂处理： 对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理， 提取上清说　明　书 1/4 页 3 CN 114958721 A 3