(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210664488.2 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 南京同凯兆业 生物技术有限责任公 司 地址 211806 江苏省南京市浦口区双峰路8 号 (72)发明人 陈晓春　张磊　汤亦文　汤春霞　 蔡家栋　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 专利代理师 仲凌霞　肖明芳 (51)Int.Cl. C12N 1/18(2006.01) C12M 1/04(2006.01) C12M 1/12(2006.01) C12M 1/00(2006.01)C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿 酒酵母的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用连续发酵分离一体 化技术培养酿酒酵母的方法， 包括以下步骤： (1) 将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中进行间 歇发酵； (2)在所述间歇发酵的对数生长期开始 加入补料培养基， 进行连续发酵， 所得发酵液经 微滤膜微滤， 所得微滤膜透过液加入 连续发酵体 系中进行连续发酵。 本发明所提供的方法， 以糖 蜜和葡萄糖为碳源， 加入其它无机盐离子， 通过 连续发酵与微滤膜处理的耦合技术， 始终保持菌 体发酵处于指数生长期， 可连续发酵60天以上， 且发酵液中干菌浓度可达21～24g/L， 干菌中核 糖核酸含量达20％以上。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115044489 A 2022.09.13 CN 115044489 A 1.一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿酒酵母的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)将酿酒酵母种子液接种到发酵培 养基中进行间歇发酵； (2)在所述间歇发酵的对数生长期开始加入补料培养基， 进行连续发酵， 所得发酵液经 微滤膜微滤， 所 得微滤膜透过 液加入连续发酵体系中进行 连续发酵。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述酿酒酵母种子液按照5％～ 20％接种到发酵培 养基中进行间歇发酵。 3.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述间歇发酵的过程中， 控制温 度为25～3 5℃， pH为3.9 ±0.5， 气液比为0.5 ‑5:1， 罐压为0.0 6～0.12MPa。 4.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述发酵培养基的配方为： 还原 糖3～6g/L、 葡萄糖20～40g/L、 (NH4)2SO4 1～4g/L、 MgSO4 0.1～1g/L、 ZnSO40.01～0.05g/L、 FeSO4 0.01～0.05g/L、 KH2PO4 0.1～0.5g/L、 酵母膏1～5g/L、 H3PO4 1～4mL/L， 溶剂为清糖 水溶液。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 当发酵液中干菌浓度达到12～ 16g/L时开始加入补料培 养基， 进行 连续发酵。 6.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 控制补料培养基的加入速率， 使 得稀释率 为0.1‑0.8h‑1。 7.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述补料培养基的配方为： 还原 糖2～4g/L、 葡萄糖15～30g/L、 (NH4)2SO4 1～3g/L、 MgSO4 0.1～0.5g/L、 ZnSO40.01～0.03g/ L、 FeSO4 0.01～0.03g/L、 KH2PO4 0.05～0.3g/L、 酵母膏1～3g/L、 H3PO40.05～0.2mL/L， 溶剂 为清糖水 溶液。 8.根据权利要求4或7所述方法， 其特征在于， 所述清糖水溶液的制备方法为： 将甘蔗糖 蜜用水稀释后， 调pH至2.0～3.5， 加热至95～100℃保温20min， 通风0.5～1h， 再调节pH至 5.5～7.0， 自然沉降12 ～16h， 所得上清液即为清糖水 溶液。 9.根据权利 要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述微滤膜的孔径为0.02～0.5 μ m。 10.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述微滤的压力为0.08～ 0.2MPa， 温度为3 0～40℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044489 A 2一种利用连续发酵分离一体 化技术培养酿酒酵母的方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿 酒酵母的方法。 背景技术 [0002]核糖核酸(RNA)是一类十分重要的生物 大分子， 普遍存在于动物、 植物和微生物细 胞中， 不仅在基因的表达和蛋白质的生物合成起着关键的作用， 而且还能促进细胞 的诸多 生理功能。 核糖核酸主要用于酶解生 成AMP、 GMP、 CMP和UMP四种5 ′ –核苷酸， 核苷 酸在细胞结 构、 代谢、 能量和调节等方面起着重要的作用， 已在医药、 食品及农业生产上得到广泛的应 用。 因此， 核糖核酸的开发研究受到越来越多的关注。 [0003]微生物是工业上大量生产核酸的原 料， 其中以酵母最为理想， 这是因为： 1、 酵母中 的核酸主要是RNA(2.67～16.0％)， DNA含量很少(0.03～0.516％)； 2、 酵母菌体较易收集， RNA也易于分离； 3、 能够得到大量纯度高、 浊度低的优质RNA； 4、 酵母培养容易， 对培养基的 要求极低； 5、 酵母 可以连续培养； 6、 提取核糖核酸后的脱核 酵母可以作为优质的蛋白饲料。 啤酒酵母中RNA的含量一般在6％～8％， 热带假丝酵母中RNA的含量一般在8％以上。 目前以 酵母提取RNA的方法被广泛采用， 工艺简单、 成本低， 但却收率较低， 核酸产品的质量和产量 都不能满足市场的需求。 [0004]在酵母的培养过程中， 一般都是由廉价的废糖蜜来提供碳源， 但由此产生的废水 一个突出的特点就是污染物浓度高： 化学耗氧量COD6～12万mg.L‑1， 生化耗氧量BOD4～6万 mg.L‑1； 废水中固形物高， 其中主要为残糖、 蛋白质、 纤维素、 胶体物质、 无机盐等； 呈酸性， 含 有硫酸根、 有机酸等， 对碳钢设备腐蚀严重； 含有较高的焦糖色素、 酚类色素、 多糖分解产 物 等， 色度高， 大多呈棕黑色。 这给环境和厂家都造成了 很大的负担 。 [0005]目前发酵工厂用得最多的还是传统的机械搅拌发酵罐， 但通气发酵罐的气体分散 和料夜循环主要由搅拌器来完成， 它存在能量消耗大、 罐内结构复杂， 染菌机会较多、 设备 造价高等缺点。 采用气升发酵罐可以克服上述缺点， 气升式发酵罐结构简单， 不需搅拌设 备， 避免了机械搅拌中轴承不严所带来的杂菌污染问题， 氧传质效率高， 能耗低， 安装维修 方便。 发明内容 [0006]发明目的： 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足， 提供一种操作简 单、 劳动强度小、 能耗低、 降低环保成本、 适 合工业化大生产的高效生产核糖核酸的方法。 [0007]为了解决上述技术问题， 本发明公开了一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿 酒酵母的方法， 在酿酒酵母发酵 的对数生长中期开始连续补料发酵， 并耦合微滤膜分离技 术， 使分离出的培 养基母液重新得以利用。 [0008]具体地， 所述方法包括以下步骤： [0009](1)将酿酒酵母斜面培养基上以29～32℃条件进行活化， 活化后菌种接种到摇瓶说　明　书 1/6 页 3 CN 115044489 A 3