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SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3498—2013 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for Plesiomonas shigelloides fromGarra rufa 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3498—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人:余华、杨光友、王昱、严玉宝、李应国、岳川、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟、 崔鹏博。 行业标准信息服务平台 SN/T3498—2013 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范 1范围 本标规定了温泉鱼类志贺单胞菌病的检疫技术规范 本标准适用于温泉鱼类志贺邻单胞菌病的临床诊断和分离鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床诊断 3.1临床症状 鱼群出现厌食或不吃食;病鱼静止不动或阵发性乱游、乱窜,或在池边摩擦,最后衰竭而死;鱼体出 现体色异常,呈现黑色;死鱼有较明显的出血症状。 3.2病理变化 病鱼鳍条基部及鱼体两侧轻度充血,体表侧线两侧出现白斑或溃疡斑,随着病情的加重,斑的颜色 逐渐变深,严重病情时斑的颜色呈现黑色,鳃盖周围有出血点或出血斑;鳃、肝、肾的颜色均较淡,呈现灰 白色;肝脏出现出血点,胆囊肿大;腹腔内积有腹水,腹水呈淡黄色透明或红色浑浊;肠道出血或肠壁变 透明,可见肠内容物 疫病的详细描述参见附录A。 4分离鉴定 4.1设备和器械 4.1.1生物安全柜。 4.1.2音 普通光学显微镜。 4.1.3高压灭菌锅。 4.1.4恒温培养箱(37℃±1℃)。 4.1.5解剖器械。 4.1.6全自动生化鉴定系统。 4.2培养基和试剂 以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的二级水。 4.2.1普通营养琼脂平板,制备见附录B的B.1。 1 SN/T3498—2013 4.2.2革兰氏染色液,配制见B.2~B.4。 4.2.3SIM培养基,配制见B.5。 4.2.4Kovacs试剂,配制见B.6。 4.2.5市售触酶试剂。 4.2.6市售氧化酶试剂。 4.2.7糖发酵试验管,配制见B.7。 4.2.8O/129诊断纸片,制作见B.8。 4.2.9市售生化鉴定管(具体名称见附录C)。 4.3类志贺邻单胞菌的分离和鉴定 4.3.1样品采集 挑选5~10尾濒死的或带有上述症状的温泉鱼,使用无菌水冲洗体表后,用75%的酒精棉球擦拭 体表,无菌操作解剖发病温泉鱼,采用接种环从病鱼出血点或出血斑处、肝脏、脾脏和肾脏蘸取渗出物 4.3.2分离和纯化 接种环划线接种到普通营养琼脂平板培养基,37℃恒温培养24h。挑取数个可疑单菌落,划线培 长良好,形成边缘整齐、表面湿润、中央隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黄色的圆形菌落。 4.3.3鉴定 4.3.3.1染色镜检 挑取疑似菌落涂片到干净的玻璃载玻片,在酒精灯火焰上方固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水 洗;滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗;滴加95%乙醇脱色,约30s(或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去, 再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s水洗;滴加沙黄复染液,复染1min;水洗,风干,镜检。志贺邻单胞菌 为革兰氏阴性直杆菌,两端圆润,染色呈红色。 标准信 4.3.3.2初步生化试验 4.3.3.2.1氧化酶试验 挑取少许单菌落涂抹于无菌的白色的滤纸片上,滴加1%盐酸四甲基对苯二胺(或商品化)氧化酶 4.3.3.2.2触酶试验 挑取少许单菌落涂抹于干净的载玻片上,滴加2~3滴3%过氧乙酸(或商品化)触酶试剂,10s~20s 出现大量气泡者为阳性,否则为阴性。 4.3.3.2.3运动性和吲哚试验 取氧化酶、触酶阳性菌落穿刺接种SIM培养基,37℃培养24h,观察。细菌沿穿刺线向两侧扩增 者为具运动性,否则为不具运动性;往管中加人数滴三氯甲烷(此时不要与火接触),2min后再向管中 加数滴Kovacs试剂,出现红色者为吲哚阳性,否则为阴性。 4.3.3.2.4糖发酵试验 挑取吲哚阳性,有运动活性的可疑菌落少许。分别接种葡萄糖、麦芽糖发酵管(见B.7)。37℃培 2
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