ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27530—2011 牛出血性败血病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine haemorrhagic septicaemia 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27530—2011 前言 本标准的附录A、附录B和附录C为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：甘肃农业大学。 本标准主要起草人：胡永浩、包世俊、伏小平、曾巧英、温峰琴、杨学山、邢小勇、郝宝成、项海涛。 1 GB/T27530—2011 牛出血性败血病诊断技术 1范围 学诊断的方法和技术要求。 本标准适用于口岸、产地及集散地牛出血性败血病的诊断、检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。 3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 AGID：琼脂凝胶扩散试验（agargelimmunodiffusiontest) CIEP：对流免疫电泳试验（counterimmunoelectrophoresistest) CSY：酪蛋白-蔗糖-酵母琼脂（casein/sucrose/yeastagar） HS：出血性败血病（haemorrhagic septicaemia) IHA：间接血凝试验(indirect haemagglutination test) PB：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer） RBCs：红细胞（redbloodcells） 4临床与病理学诊断 4.1流行特征 黄牛、水牛、耗牛和奶牛均可感染发病。患病动物、带菌动物为传染来源。有时，健康畜禽的口腔、 扁桃体和上呼吸道带菌。畜群中发生巴氏杆菌病而查不出传染源时，一般认为家畜在发病前已经带菌。 病畜由其排泄物、分泌物排出有毒力的病菌，污染饲料、饮水、用具和外界环境，经消化道而传染给健康 家畜。或由咳嗽、喷嚏排出病菌，通过飞沫经呼吸道发生传染。也可通过有伤口的皮肤、黏膜发生传染。 吸血昆虫叮咬也可传播病菌。 本病的发生一般无明显的季节性。通常呈散发性流行，在畜群中少数几头动物先后发病。水牛、耗 牛有时可呈地方性流行。发病率、病死率均高。寒冷、闷热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、圈舍通风 不良、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素。 4.2临床症状 4.2.1败血型：病牛病初体温高达41℃~42℃，呼吸及心跳加快，鼻镜干裂，皮温不整，食欲减退甚至 废绝。病初便秘，后腹泻，粪便始呈粥样，后为液状并混有黏液、黏膜片及血液，恶臭。有时出现鼻漏和 血尿。腹泻开始后体温下降，不久即死亡。病程多为12h～24h， 4.2.2浮肿型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的 炎性水肿，同时伴有舌及周围组织的高度肿胀，舌多伸出齿外，呈暗红色。呼吸高度困难，皮肤和黏膜发 ，常因室息或下痢而死。病程多为12h～36h。 1 GB/T27530—2011 4.2.3肺炎型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状。 体温升高，呼吸困难，干咳，流泡沫样鼻液，后鼻液呈脓性。胸部叩诊有痛感。病初便秘，后腹泻，粪便恶 臭并混有血液。病程一般3d～7d左右。 4.3病理剖检 4.3.1败血型：皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点。胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大肠 常见出血性炎症，肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿。脾点状出血但不肿大。肺淤血、 水肿。 咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀。上呼吸道黏膜卡他性炎症。 4.3.3肺炎型：胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液，肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜，肺 脏切面呈大理石状。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物。胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症。淋 巴结肿大，呈紫色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵隔淋巴结最为明显， 4.3.4依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断，确诊要进行病原学诊断。 5病原学诊断 5.1病料采集及处理 无菌采集病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、淋巴结等新鲜病料，及时送检或置冷暗处保存 备用。死亡时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料。可现场制作病料涂片或触片，供染色镜检。 5.2染色镜检 采集病料涂片或触片，染色后置显微镜下观察。革兰氏染色（按GB/T4789.28—2003中2.2规定 操作）可见革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌，菌体大小为（0.2μm～0.4μm）×（0.6μm～2.5μm）。瑞氏 染色（按GB/T4789.28—2003中2.6规定操作）和美蓝染色（按GB/T4789.28—2003中2.1规定操 作）时菌体两极浓染，印度墨汁染色（见附录A）可见明显的荚膜。 慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌，应该经分离培养后再行染色镜检。 镜检观察到典型菌体，结合流行特点、症状和病变，可初步诊断为本病。进一步进行病原分离鉴定 以作出确切诊断。 5.3病原分离鉴定 5.3.1病原分离 病料分别接种麦康凯琼脂培养基（见附录B）、酪蛋白-蔗糖-酵母（CSY)琼脂培养基（见附录B)和鲜 血琼脂培养基（见附录B），置37℃条件下培养18h～24h后，挑选可疑菌落进行鉴定。当病料中细菌 含量小时，可用5%血清肉汤（按照GB/T4789.28一2003）于37℃进行增菌培养。 5.3.2病原鉴定 5.3.2.1培养特性 多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长。在血液琼脂培养基上经18h～24h后可长成圆 形、光滑、湿润、有灰白色光泽的半透明菌落，直径纳1mm，菌落周围无溶血现象。在CSY琼脂培养基 上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落。老龄培养物，特别是在无血培养基上的老龄培养物，形成的 菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。 5.3.2.2菌体形态 取血液琼脂培养基上生长18h～24h的典型菌落涂片，革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌， 菌体大小为(0.2μm~0.4μm）×（0.6μm~2.5μm）。 5.3.2.3生化试验 5.3.2.3.1取纯培养的待检菌少许接种发酵管（见附录B)，置37℃培养，每天观察并记录结果。多杀 性巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气；不发酵棉子糖、乳糖、鼠李 2 GB/T 27530—2011 糖、菊糖、水杨苷、肌醇。 5.3.2.3.2MRVP试验（按GB/T4789.28—2003中3.4规定操作）阴性。 5.3.2.3.3吲哚试验（按GB/T4789.28—2003中3.13规定操作）阳性。 5.3.2.3.4氧化酶试验（按GB/T4789.28—2003中3.18规定操作）、过氧化氢酶试验（按GB/T4789.28- 2003中3.20规定操作）阳性，β-半乳糖苷酶试验（按GB/T4789.282003中3.3规定操作）、脲酶试验 （按GB/T4789.28-2003中3.15规定操作）阴性。 5.3.2.3.5硝酸盐还原试验（按GB/T4789.282003中3.17规定操作）阳性，柠檬酸盐利用试验（按 GB/T4789.28—2003中3.5规定操作)阴性。 5.3.2.3.6硫化氢试验（按GB/T4789.28一2003中3.14规定操作）阴性，明胶液化试验（按 GB/T4789.282003中3.10规定操作）阴性。 5.3.2.3.7依据病原培养特性、菌体形态、生化试验，符合多杀性巴氏杆菌特征者可作出确定诊断。必 要时进行血清分型试验和动物接种试验。 5.3.2.4血清分型试验 5.3.2.4.1间接血凝试验 5.3.2.4.1.1材料 所用材料如下所示： 标准菌及待检菌荚膜抗原（见附录C)。 b) 特异性抗血清（见附录C)。 1%新鲜绵羊红细胞（见附录C)。 c) 致敏绵羊红细胞（见附录C）。 e) 阿氏液（Alsever's液）（见附录A）。 f) 80孔血凝反应板（大孔板）。 5.3.2.4.1.2方法 间接血凝试验方法步骤如下所示： 反应板每排第1孔加人0.85%NaCI溶液0.72mL，自第2孔起各孔分别加人0.85%NaCl a) 溶液0.4mL。 b) 各型特异性抗血清各自单独一排稀释,第1孔加人血清0.08mL,混匀，移取0.4mL到下一 孔。同样方法稀释至第7孔。 c) 每孔加人0.4mL致敏绵羊红细胞。 同时设如下对照： 血清对照：血清（10倍稀释）0.4mL十加1%新鲜绵羊红细胞0.4mL。 绵羊红细胞对照：1%新鲜绵羊红细胞0.4mL十0.85%NaCl溶液0.4mL。 抗原对照：1%致敏绵羊红细胞0.4mL十0.85%NaCl溶液0.4mL。 反应程序见表1。 表 1 间接血凝试验（英膜分型）反应程序 8（抗体 9（抗原 10（绵羊红 孔 号 2 3 4 5 6 7 对照） 对照） 细胞对照） 血清稀释倍数 20 40 80 160 320 640 1280 含0.3%甲醛的0.85%NaCI/mL 0.72) 0.4) 0.4) 0. 4) 0.4) 0.4) 0, 4) 0.36 0. 4 0. 4 *0.4 型特异性抗血