ICS 11. 020 05 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T263492010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 Test methods of fly resistance to insecticides- Test methods of insensitive acetylcholinesterase for musca domestica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26349—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的起草规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位：中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人：高希武、曾晓芃、梁沛、马彦、刘婷、颖、赵彤言 1 GB/T 26349—2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 1范围 本标准规定了家蝇（Muscadomestica）不敏感乙酰胆碱酯酶（AChE)的检测方法。 本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminating concentration of acetylcholinesterase 能够抑制敏感品系家蝇乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度，单位为mol/L或 mmol/L. 2. 2 F1 代 F1generation 从现场捕提捉的家蝇，繁殖后得到的第一代。 3试虫 现场采集家蝇，室内饲养，羽化后3d～5d的F1代雌性家蝇。冰浴条件下储存不超过1d， 4试剂 4.1 磷酸氢二钠（NazHPO,），化学纯。 4.2磷酸二氢钾（KH,PO），化学纯。 4.3曲拉通X-100（TritonX-100）。 4.42 乙酰硫代胆碱（ATCh），分析纯 4.55,5-二硫双硝基苯甲酸（DTNB)，分析纯。 4.6磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNazHPO,·12H,O和2.16gKH,PO，蒸馏 水定容至1000mL。 4.7DTNB-乙醇显色剂：称取12.4mgDTNB，溶于125mL95%乙醇中，加人50mL磷酸缓冲液，最 后用蒸馏水定容至250mL，4℃避光保存。 4.8 ATCh溶液：称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中，一20℃避光保存。 5分光光度法 5.1仪器设备 5.1.1分光光度计。 1 GB/T 26349—2010 5.1.2恒温水浴箱。 5.1.3玻璃组织匀浆器。 5.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）。 5.1.5加液器。 5.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX 在反应体系中的最终浓度应小于1%。 5.3操作步骤 5.3.1取家蝇1只，用眼科剪刀或手术刀片将头部剪（切）下，放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器（1mL） 中，加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100），充分匀浆。 5.3.2匀浆液在4℃，10000g离心15min，取上清液即为酶液，冰浴保存备用。 5.3.3取4支试管，分别加人上述酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加入一定量的杀虫药剂溶液 0.1mL，使其终浓度达到区分剂量，第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管；另取 1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照。 5.3.4上述5支试管30℃保温5min后，分别加人0.1mLATCh，在30℃继续保温15min后，加人 1.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.3.5以空白对照调仪器0点，在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的 光密度值（OD412）。 5.3.6按上述方法每个种群检测100只家蝇。 5.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式（1)： OD×100% E= .(1) OD. 式中： E —AChE残存活性； OD——药剂处理管平均光密度值OD12 OD。——无药剂对照管平均光密度值ODa12。 5.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE，具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。 6酶标仪法 6.1仪器设备 6.1.1酶标仪。 6.1.2恒温水浴箱。 6.1.3玻璃组织匀浆器。 2 GB/T26349—2010 6.1.4台式冷冻离心机（离心力10000g以上）。 6.1.5加液器。 6.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，试验前用磷酸盐缓冲液（含0.1%Triton X-100)稀释到区分浓度（常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A.2)的 2.5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。 6.3操作步骤 6.3.1取家蝇1只，用眼科剪刀或手术刀片将头部剪下，放人4℃预冷的玻璃组织勾浆器（1mL）中， 加入0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液（含0.1%TritonX-100），充分匀浆。 6.3.3在酶标板孔中加人0.1mL酶液，在每个孔中分别加人0.05mLDTNB和0.1mL含抑制剂的 ATCh溶液，抑制剂终浓度为区分浓度，每只家蝇设无抑制剂对照一个，用缓冲液代替抑制剂量，在酶标 仪中读数5min，曲线的斜率作为反应初速度（v）。计算平均值。 6.3.4按上述方法每个种群检测100只家蝇。 6.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式（2）： E=竺×100% .(2) Ve 式中： E 一一AChE残存活性； 药剂处理组平均反应初速度； 无药剂对照组平均反应初速度。 6.5判别标准 类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。