ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T31730—2015 膜芯片法 水稻中转基因成分测定 Detection of genetically modified components in rice- Membrane-based array method 2015-06-02发布 2015-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31730—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院归口。 测站。 本标准主要起草人：黄广平、云振宇、尹志坚、胡太贵、孙昭、张瑶、王勇强、董玖红、宋廷瑞、张金龙 刘贞， I GB/T 31730—2015 水稻中转基因成分测定 膜芯片法 1范围 本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法。 的快速定性检测，也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测。 本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/kg。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 转基因产品检测 基因芯片检测方法 GB/T19495.6 GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate) dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） bp：碱基对(basepair) BAR：草丁麟乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferasegene） CrylAb：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA（b）基因［Bacillusthuringiensisinsecticidaltoxin crylA(b) gene) sac CrylAc：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA（c）基因［Bacillusthuringiensis insecticidaltoxin crylA(c) gene] 1 GB/T31730—2015 CaMV35S-P：花椰菜花叶病毒的35S启动子（promoterfromcauliflowermosaicvirus） NOS-3'：胭脂碱合成酶基因终止子（termination sequenceof the nopaline synthasegene） CaMV35S-T：花椰菜花叶病毒的35S终止子（terminationsequencefromcauliflowermosaicvirus) GOS9:水稻gos9基因[Oryza sativa（rice）gos9 gene] PC：阳性对照（positivecontrol) NC：阴性对照（negative control) UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）（uracilN-glycosylase） Taq 酶:Thermus aquaticus DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNA polymerase) AminolinkerC6：6个碳原子作为连接臂的氨基标记（C6Aminolinker） 4原理 根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物，对样本进行多重PCR 扩增。PCR引物上修饰有生物素。若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物，PCR产物与固定有 目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交。杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应，以及 碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色，则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号。依据膜芯片上杂 交点的显色情况，判断样本中是否含有待检转基因成分，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读 仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。 5试剂与标准品 5.1试剂 5.1.1试剂组分 本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.25.1.4的规定。除非另有规定.本方法中所用 试剂均为分析纯.水为GB/T6682规定的二级水， 5.1.2 引物 PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。 表1PCR反应使用的引物序列 目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小 Forward 5'-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3' 193 bp BAR Reverse 5'-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3' Forward 5'-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3' CrylAb 164 bp Reverse 5'-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3 Forward 5°-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3′ CrylAc 161 bp Reverse 5'-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3' Forward 5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3" 144 bp CaMV35S-P Reverse 5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3' 2 GB/T 31730—2015 表1(续) 目标基因 引物名称 序 列 扩增片段大小 Forward 5′-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3' 113 bp NOS-3' Reverse 5'-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3" Forward 5'-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3' CaMV35S-T 132 bp Reverse 5'-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3 Forward 5′-GACGATCCGTAGTGGAGC-3' GOS9 117 bp Reverse 5'-biotin-GTAATCGTAGTTGGATTTCCACC-3' 5.1.3 探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。 表 2 目标基因探针序列 名称 序 修饰基团 5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC BAR 5'-AminolinkerC6 GTGGGTTTCTG-3' 5°-AminolinkerC6 CrylAb CAAAGGTGGGG-3' CrylAc 5'-AminolinkerC6 TCACCTCAACGT-3 5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA- 5'-AminolinkerC6 CaMV35S-P AGTGGATTGATG-3 5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA- NOS-3" 5'-AminolinkerC6 CAAAATATAGCGC-3' 5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTT- CaMV35S-T 5'-AminolinkerC6 CTATCAATAAAAT-3' 5'-GCCTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCC- GOS9 5'-AminolinkerC6 TTGGGGTGGTGG-3' 5'-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTG- PC 5′-AminolinkerC6 TCCAAAGTACCAG-3' 5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGAT NC 5'-AminolinkerC6 GATCCTATTTTC-3' 注：阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo,10μmol/L)：核苷酸序列与阳性对照核酸探针（PC)序列互补，用于 膜芯片杂交过程质量控制，5'端带生物素（biotin)标记，序列如下： 5.1.4 其他试剂 5.1.4.1 碱性磷酸酶标记链霉亲和素（AP-streptavidin）。 5.1.4.2 碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT)。 3