ICS 67.120.30 X 20 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T315202015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 Determination of astaxanthin in Haematococcus- High performance liquid chromatography method 2015-05-15发布 2015-05-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31520—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会（SAC/TC156/SC3）归口。 本标准主要起草人：孙伟红、张勇、冷凯良、徐春媚、刘建国、吴秋瑾、邢丽红、苗均魁、肖荣辉、孙来娣 翟毓秀、许洋， I GB/T31520—2015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 1范围 本标准规定了红球藻（Haematococcus）中虾青素的液相色谱测定方法。 本标准适用于雨生红球藻（Haematococcuspluuialis）藻粉中虾青素含量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样经二氯甲烷与甲醇混合溶液提取，氢氧化钠甲醇溶液皂化，使其中的虾青素酯转化成游离态的 虾青素，经C3o反相液相色谱柱分离后，用配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量， 4试剂 所用试剂除另有规定外均为色谱纯。 4.1 试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 4.2丙酮。 4.3 磷酸：优级纯。 4.4 氢氧化钠：优级纯。 4.5 甲醇。 4.6 二氯甲烷。 4.7 叔丁基甲基醚。 4.826-二叔丁基对甲酚：化学纯。 4.10 二氯甲烷-甲醇溶液：量取250mL二氯甲烷和750ml甲醇，加入0.5g2，6-二叔丁基对甲酚 （4.8），混匀后备用。 备用。 4.122%磷酸-甲醇溶液（体积分数）：量取2mL磷酸（4.3）和98mL甲醇，混匀后备用。 4.13全反式虾青素、13-顺虾青素、9-顺虾青素标准品：纯度≥95%。 4.14全反式虾青素标准储备溶液：准确称取全反式虾青素标准品约10mg，用丙酮溶解并定容于 500mL容量瓶中，此溶液浓度为20μg/mL，充氮密封，置一18℃冰箱中避光保存，有效期1个月。 1 GB/T31520—2015 4.1513-顺虾青素标准储备溶液：准确称取13-顺虾青素标准品约1mg，用丙酮溶解并定容于50mL 容量瓶中，此溶液浓度为20μg/mL，充氮密封，置一18℃冰箱中避光保存，有效期1个月。 4.169-顺虾青素标准储备溶液：准确称取9-顺虾青素标准品约1mg，用丙酮溶解并定容于50mL容 量瓶中，此溶液浓度为20μg/mL，充氮密封，置一18℃冰箱中避光保存，有效期1个月。 4.17全反式虾青素标准工作溶液：准确移取适量全反式虾青素标准储备溶液（4.14)用丙酮稀释成浓 度分别为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的标准工作液，现 配现用。 的标准工作液，用于定性，现配现用。 4.199-顺虾青素标准工作溶液：准确移取9-顺虾青素标准储备溶液（4.16），用内酮配制成适当浓度的 标准工作液，用于定性，现配现用。 SAG 5仪器 5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器 5.2 分析天平：感量0.00001g0.0001g各一台。 5.3 超声波清洗机。 5.4 冷冻离心机：8000r/min。 5.5 旋涡混合器。 5.6 氮吹仪。 5.7 具塞聚丙烯离心管：50mL。 5.8 棕色容量瓶：50mL。 5.9 棕色比色管：10mL。 5.10 玻璃匀浆器：10mL。 6测定步骤 6.1提取 准确称取雨生红球藻粉50mg~100mg（精确到0.1mg），置于干燥的玻璃勾浆器中，加人1mL二 氯甲烷-甲醇溶液（4.10）充分研磨使细胞壁破碎完全，转移至50mL离心管中，用10mL二氯甲烷-甲醇 溶液（4.10）分3次清洗玻璃匀浆器，合并提取液。超声提取5min，5℃下8000r/min离心5min，将上 清液转移至50mL容量瓶中，离心管中再加人10mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10），重复上述步骤3次以 上，直到提取后的藻渣为白色，合并上清液，用二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）定容至50mL，然后静置 15min。准确移取5mL上清液于另一50mL容量瓶中，用二氯甲烧-甲醇溶液（4.10）稀释并定容，备用。 注：虾青素含量高于2%的雨生红球藻粉的称样量不大于50mg。 6.2皂化 从上述容量瓶中准确移取5mL溶液于10mL比色管中，加人0.7mL氢氧化钠-甲醇溶液（4.11）， 涡旋混合，充氮密封，在5℃冰箱中反应过夜12h14h。然后在反应液中加入0.4mL2%磷酸-甲醇 注：若试样溶液的色谱图中，在20min～30min的出峰处存在杂峰，将加碱量提高一倍后重新取提取液皂化， 2 GB/T31520—2015 6.3测定 6.3.1 色谱条件 6.3.1.1 色谱柱：C3o色谱柱，250mm×4.6mm，5um，或相当者。 6.3.1.2 柱温：25℃。 6.3.1.3 检测器：检测波长为474nm。 6.3.1.4 进样量：20μL。 6.3.1.5 流速:1.0 mL/min。 6.3.1.6 流动相：梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间/min A/% B/% C/% 0 81 15 4 15 66 30 4 23 16 80 4 27 16 80 4 30 81 15 4 35 81 15 4 注：A为甲醇,B为叔丁基甲基醚，C为1%磷酸溶液。 6.3.2 定性方法 分别注入20μL适当浓度的全反式虾青素标准工作液（4.17）、13-顺虾青素标准工作液（4.18）、9-顺 虾青素标准工作液（4.19）及试样溶液（6.2），按6.3.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定，根据标准 工作液色谱图中三种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。标准品色谱图参见附录A。 6.3.3定量方法 根据试样溶液中虾青素的含量情况，选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多 点校准定量，试样测定结果以三种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时标准工作液和样液的 响应值均应在仪器检测的线性范围之内。 结果计算 7 试样中虾青素的含量（X）以质量分数计（%），按式（1)计算，保留3位有效数字。 (1.3XA13-eis+Atranx+1.1XA,eis)XC,×V×10-3 X : X f × 100% ........(1) AXm 式中： X 样品中虾青素的含量，%； 3