ICS 67.140.10 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T30483—2013 高效液相色谱法 茶叶中茶黄素的测定 Determination of theaflavins in tea-High performance liquid chromatography 2013-12-31发布 2014-06-22实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30483—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国茶叶标准化技术委员会（SAC/TC339）归口。 本标准主要起草人：周卫龙、徐建峰、陆小磊、许凌、叶美君。 I GB/T30483—2013 茶叶中茶黄素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了用高效液相色谱（HPLC)测定茶及茶制品中茶黄素含量的仪器、试剂、操作方法、结 果计算。 本标准适用于茶及茶制品中茶黄素含量的测定，也适用于咖啡碱、儿茶素及没食子酸的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 2茶取样 GB/T 8302 GB/T 8303 3茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定 3原理 茶叶磨碎试样中的茶黄素（儿茶素）用70%的甲醇溶液在70℃水浴上提取，速溶茶用热的10%乙 腈溶解。茶黄素（儿茶素）的测定用Ci8柱、检测波长278nm、梯度洗脱、HPLC分析，用茶黄素（儿茶素） 标准物质外标法直接定量。 4仪器 4.1 分析天平：感量0.0001g。 4.2水浴。 4.3 离心机：转速3500r/min。 4.4 混匀器。 4.5 高效液相色谱仪（HPLC）：包含梯度洗脱及紫外检测器（检测波长278nm）。 4.6 液相色谱柱：Cg（粒径5μm，250mmX4.6mm）。 5试剂 5.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯（AR），水为蒸馏水。 5.2 乙睛：色谱纯。 5.3甲醇。 5.4冰乙酸。 5.570%甲醇水溶液（体积分数）。 5.61 10mg/mLEDTA-2Na溶液：现配。 5.71 10mg/mL抗坏血酸溶液：现配。 5.8 稳定溶液：分别将25mLEDTA-2Na溶液（5.6），25mL抗坏血酸溶液（5.7），50mL乙睛（5.2）加 1 GB/T304832013 入500mL容量瓶中，用水定容至刻度摇匀。 5.9液相色谱流动相 5.9.1流动相A：分别将90mL乙晴（5.2），20mL冰乙酸（5.4），2mLEDTA-2Na（5.6）加人1L容量 瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液需过0.45um膜。 5.9.2流动相B：分别将800mL乙腈（5.2），20mL冰乙酸（5.4），2mLEDTA-2Na（5.6）加人1L容量 瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液需过0.45μm膜。 5.10标准储备溶液 5.10.1咖啡碱储备溶液：2.00mg/mL。 5.10.2没食子酸（GA）储备溶液：0.100mg/mL。 5.10.3儿茶素储备溶液：+C1.00mg/mL,EC1.00mg/mL,EGC2.00mg/mL，EGCG2.00mg/mL， ECG 2.00 mg/mL. 5.10.4茶黄素储备溶液:TF2.00mg/mL,TF-3-G2.00mg/mL,TF-3-G2.00mg/mL，TFDG2.00 mg/mL. 5.11标准工作溶液：用稳定溶液（5.8）配制。 标准工作溶液的浓度：没食子酸5μg/mL~25μg/mL、咖啡碱50μg/mL～150μg/mL、 +C50 μg/mL~150 μg/mL,EC 50μg/mL~150 μg/mL,EGC 100 μg/mL~300μg/mL、EGCG 100 μg/mL~400 μg/mL、ECG 50 μg/mL~200 μg/mL、TF 100 μg/mL~300 μg/mL、TF-3-G 100 μg/mL~300 μg/mL、TF-3-G100 μg/mL~300 μg/mL,TFDG 100 μg/mL~300 μg/mL。 6操作方法 6.1取样 按GB/T8302的规定。 6.2试样制备 按GB/T8303的规定。 6.3 测定步骤 SAC 6.3.1干物质含量测定 按GB/T8303的规定。 6.3.2供试液的制备 6.3.2.1茶叶：称取0.2g（精确到0.0001g）均匀磨碎的试样（6.2）于10mL玻璃离心管中，加人在 70℃中预热过的70%甲醇溶液（5.5）5mL，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入70℃水浴（4.2）中， 浸提10min（隔5min搅拌一次），浸提后冷却至室温，转入离心机（4.3）在3500r/min转速下离心 10min，将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。 合并提取液定容至10mL，摇（该提取液在4℃下可至多保存24h）。用移液管移取上述提取液2mL 至10mL容量瓶中，用稳定溶液（5.8）定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜，待测。 6.3.2.2速溶茶：称取0.5g（精确到0.0001g）均匀的速溶茶于50mL容量瓶，加入不高于60℃的水 溶解，加5mL乙睛（5.2）并用水定容至刻度，摇匀。用移液管移取上述提取液2mL至10mL容量瓶 中，用稳定溶液（5.8）定容至刻度，摇匀，过0.45um膜，待测。 GB/T 30483—2013 6.3.3色谱条件 流动相流速：1mL/min；柱温：35℃紫外检测器：入=278nm。 梯度条件： 100%A相保持10min 15min内由100%A相→68%A相、32%B相 68%A相、32%B相保持10min； 100%A相 6.3.4测定 待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸1OuL混合标准系列工作液注射入HPLC。在相 同的色谱条件下注射10μL测试液。测试液以峰面积定量。 7结果计算 7.1计算方法 茶叶中茶黄素（儿茶素、咖啡碱、没食子酸）含量以干态质量分数（%）表示，按式（1）计算： AXf stdXVXd 茶黄素（儿茶素、咖啡碱、没食子酸）含量= X 100% .....() mX10°Xw 式中： A 所测样品中被测成分的峰面积； fstd 所测成分的校正因子（浓度/峰面积，浓度单位ug/mI）； V 样品提取液的体积，单位为毫升（mL）； d 稀释因子（通常为2mL稀释成10mL则其稀释因子为5）； m 样品称取量，单位为克（g）； m 样品的干物质含量（质量分数），% 7.2茶黄素（儿茶素类）总量计算公式 茶黄素总量按式（2)计算： 茶黄素总量=TF+TF-3-G+TF-3'-G+TFDG ...(2 ) 儿茶素总量按式（3)计算： 儿茶素总量=EGC+C+EC+EGCG+ECG ..(3) 如果符合重复性（7.3），取两次测定的算术平均值作为结果，保留小数点后2位。 7.3重复性 在重复条件下同一样品获得的茶黄素总量（儿茶素总量、咖啡碱含量，没食子酸含量）测定结果的绝 对差值不得超过算术平均值的10%。