ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 36875—2018 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 Method of RT-nPCR for detection of classical swine fever virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36875—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：军事医学科学院军事兽医研究所、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：郭焕成、王琴、徐璐、冯烨、张乾义、赵启祖、邹兴启、朱元源、涂长春。 GB/T36875—2018 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒特异的反转录-套式聚合酶链反应（RT-nPCR)方法的技术要求。 本标准适用于可能感染猪瘟病毒的猪脏器、血液、粪便和细胞培养物中猪瘟病毒核酸的检测，可用 于猪瘟的诊断和监测 本标准的猪瘟病毒RT-nPCR方法不能区分感染的猪瘟病毒野毒株和免疫的疫苗株。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate) EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二钠（ethylene diaminetetraacetic acid disodium salt） RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RT-nPCR：反转录-套式聚合酶链反应（reversetranscriptionand nestedpolymerasechainreac tion) 3 实验前准备 3.1实验室条件 3.1.1实验室分区 PCR实验室分区包括核酸提取区、PCR反应体系配制区一一配液区、扩增区、电泳区。流程顺序为 3.1.2实验室应配备的仪器及器材 3.1.2.1仪器：Ⅱ级生物安全柜、台式高速冷冻离心机、普通冰箱（一20℃和4℃）、分析天平、PCR扩增 仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、组织研磨器、扁桃体采样器、微波炉、单道可调移 液器(2 μL、10 μL、200 μL、1 000 μL)。 3.1.2.2器材：无菌注射器、眼科剪、眼科镊、称量纸、棉拭子、灭菌牙签、500mL量筒、500mL锥形瓶、 一次性无RNA酶吸头（10μL、200uL、1000uL）、1.5mL无RNA酶离心管、0.2mL薄壁PCR管。 3.2化学药品及试剂 SAG 3.2.1总RNA提取试剂Trizol。 3.2.2TAE电泳缓冲液的制备，配制方法见附录A。 3.2.31%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A。 3.2.4其他试剂：200U/uLM-MLV反转录酶，5XM-MLV缓冲液，40U/μLRNA酶抑制剂DEPC HzO,5U/μLExTaqDNA聚合酶，10XExTaq缓冲液（Mg2+Plus），6碱基随机引物（50μmol/L）， 6×上样缓冲液，dNTPs（2.5mmol/L/dNTP），异丙醇，三氯甲烷，75%乙醇，ddH.O，漠化乙啶替代染 1 GB/T36875—2018 料，DL2000DNAMarker，阴性对照（DEPC-H,O），阳性对照（猪瘟免化弱毒疫苗、灭活的猪瘟病毒或已 知的阳性样品）。 3.2.5引物序列及配制方法，参见附录B。 4方法 4.1样品的采集、保存和运送 4.1.1采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样品间不得交叉污染。 4.1.2菜样工具 扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～ 10min，经清水冲洗；牙签经121℃高压灭菌15min；剪、镊经160℃干烤2h。 4.1.3采样及样品处理方法 4.1.3.1扁桃体样品 用鼻捻子固定活猪的上额，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至1.5ml 离心管并做标记，编号，置于样品冷藏箱送至实验室。 在实验室生物安全柜中取出待检样品置于组织研磨器，加人5倍体积4℃预冷的DEPC-H2O，充 分研磨，4℃、3000×g离心15min，取上清液转人离心管中编号备用。 4.1.3.2组织样品 采取病死猪或安乐死的猪组织和脏器（淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏和回肠等）装人一次性塑料袋或其 他灭菌容器，编号，置于样品冷藏箱送至实验室。 在实验室生物安全柜中取50mg~100mg待检组织样品置于组织研磨器，加人5倍体积4℃预冷 4.1.3.3全血样品 用无菌注射器采集全血，注入含1/10体积4%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。 4.1.3.4粪便样品 用棉拭子挑取少许新鲜粪便样品于离心管中，加人1mL生理盐水，震荡混匀，4℃、3000×g离心 15min，取上清液转人离心管中编号备用。其余液体排泄物离心后直接转入离心管编号备用。 4.1.3.5细胞培养物 51G 细胞培养物反复冻融3次，转人离心管中编号备用。 4.1.3.6存放与运送 采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置于一80℃冰箱， 且应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品放入样品管中密封后，采用保温容器加冰袋或干冰， 在24h内运送到实验室。 2 GB/T36875—2018 4.2核酸提取 4.2.1提取样品总RNA，可采用本标准中的Trizol法，也可采用其他等效试剂盒，按照试剂盒说明书 进行。 4.2.2以猪瘟兔化弱毒疫苗、灭活的猪瘟病毒或已知的阳性样品作为阳性对照，以DEPC-H2O为阴性 对照。 4.2.3按以下Trizol法进行样品总RNA提取： 取待检样品、阳性对照和阴性对照各250L置于1.5mL离心管，每管加人750uLTrizol，一 份样品换一个吸头，充分混匀，静置10min； b) 每个样品管中加200μL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也 可以用手颠倒混匀），于4℃、13000×g离心15min； 用移液器转移离心后的上清液400μL（注意不要吸出中间层）至新1.5mL无RNA酶离心管 c） 中，加等体积的异丙醇（4℃预冷），颠倒混匀，一20℃静置20min； d）于4℃、13000×g离心15min，小心倒去上清液，加人700μLDEPC-H，O配制的75%乙醇， 颠倒洗涤； e) 于4℃、8000×g离心6min，小心倒去上清液，沉淀，室温干燥10min~15min； 加人20μLDEPC-H,O，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA沉淀，冰上保存备用。提取的RNA应 在2h内进行RT扩增，若需长期保存应放至一80℃冰箱。 4.3反转录 以随机引物为反转录引物，建立20μL反转录体系，制备cDNA： dNTPs 4.0μL 随机引物 1.5 μL 5XM-MLV缓冲液 4.0 μL 反转录酶M-MLV 1.0 μL RNA酶抑制剂 1.0 μL 总RNA 8.5 μL 42℃1.5h,95℃5min。 4.4建立50μL外套PCR反应体系 O"HPP 36.7 μL 10XExTaq缓冲液（Mg2+Plus） 5.0 μL 外套上游引物 1.0 μL 外套下游引物 1.0 μL dNTPs 4.0μL ExTaqDNA聚合酶 0.3 μL cDNA 2.0 μL PCR条件:95℃5min-→(95℃45 s-→55℃1min-→72℃1min)35个循环→72℃7min-→4℃。 4.5建立50μL内套PCR反应体系 取2μL外套PCR产物作为内套PCR的模板进行套式PCR，建立50μL内套PCR反应体系： O"HPP 36.7 μL 10×ExTaq缓冲液（Mg²+Plus) 5.0 μL 3 GB/T36875—2018 内套上游引物 1.0 μL 内套下游引物 1.0 μL dNTPs 4.0 μL ExTaqDNA聚合酶 0.3 μL 2.0 μL 外套PCR产物 PCR条件:95℃5min-(95℃45s→55℃1min→72℃45s)35个循环→72℃7min→4℃ 4.6电泳 4.6.1 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（通常是1XTAE）。 4.6.2 配制1%琼脂糖凝胶（见附录A）。 4.6.3 将琼脂糖溶液倒人制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般为4mm～5mm。 4.6.4 取5μL内套PCR产物与1μL6×上样缓冲液混匀，用移液器将其加人加样孔中。 4.6.5接通电源，以120V电压进行电泳，30min后停止电泳。 4.6.6 用凝胶成像仪观察并保存结果。 4.7 结果判定 阳性对照样品的内套PCR产物出现272bp扩增带，阴性对照无扩增带出现（引物二聚体带除外） 时，实验成立。被检样品的内套PCR产物出现272bp特异性条带时，判定样品为猪瘟病毒核酸检测阳 性，否则为阴性（见图1）。 M12 272 bp 说明： MDL2000 DNA Marker; 1 阳性对照； 阴性对照。 2 图1 套式RT-PCR检测结果的电泳图示例 4.8 基因测序 根据需要，可进一步将阳性PCR扩增产物用内套PCR上游、下游引物进行双向测序，获得CSFV 的PCR扩增区基因序列。 5注意事项 5.1样品的处理和检测应在生物安全IⅡI级（BSL-2级）或以上的实验室进行。疑似猪瘟样品的分装、研 磨、离心及添加RNA提取裂解液需在Ⅱ级生物安全柜内进行。检测后的废弃物品需浸入1%次氯酸钠 4 GB/T36875—2018 溶液的污物缸内30