ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准 GB/T 35917—2018 常见动物源性成分快速测定 膜芯片法 Rapid detection for animal-derived materialsMembrane-based array method 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35917—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：中国标准化研究院、四川华汉三创生物科技有限公司、山东省食品药品检验研究 品检验研究院、江西省食品药品检验研究院、上海市兽药饲料检测所。 本标准主要起草人：云振宇、李文静、霍胜楠、吴琦、王骏、赵琳、程潇、宗凯、马晓蕾、祝建华、李云飞 余晓峰、安虹、梁恒兴、张彪、吴鑫、商军、丁卫平、韩家忠、曾莲、刘菲、张红光、黄广平。 GB/T 35917—2018 常见动物源性成分快速测定 膜芯片法 1范围 本标准规定了常见动物源性成分膜芯片检测方法的原理、试剂与仪器设备、样品制备与保存、试验 步骤、生物安全措施、结果判定、结果表述。 本标准适用于肉制品及饲料中猪、黄牛、羊、鸡、兔、驴、貂、狐、鼠、耗牛、鸭共11种常见动物源性成 分的快速定性检测。 本标准规定的动物源性成分检出限为0.1%（质量分数）。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19 肉与肉制品取样方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction;PCR 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步 骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 3.1.2 多重聚合酶链式反应 multiplex PCR 在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AminolinkerC6：6个碳原子作为连接臂的氨基标记（C6Aminolinker） ATPase6：ATP合成酶亚基6（ATPsynthase6） bp：碱基对（basepair） corl：线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因（CytochromecoxidasesubunitI） cytb：线粒体细胞色素b基因（Cytochromeb） DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) 1 GB/T35917—2018 D-loop：线粒体DNA控制区(Controlregiondisplacementloop) dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosinetriphosphate) dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidinetriphosphate） dUTP：脱氧尿苷三磷酸（Deoxyuridinetriphosphate） NC：阴性对照（Negative control) PC：阳性对照（Positivecontrol) Taq酶:Taq DNA聚合酶(TaqDNApolymerase) UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（UracilN-glycosylase） 18SrRNA基因：编码18S核糖体RNA基因(18SribosomalRNAgene) 4原理 针对肉制品及饲料中常见动物源性成分特异性基因片段设计引物，对DNA模板进行多重聚合酶 链式反应扩增，扩增产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交，经化学显色后可在杂交点上 形成肉眼可见的杂交信号。 5试剂 5.1试剂组分 试剂组分和存放条件参见附录A。试验用水应符合GB/T6682的要求。 5.2引物 PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。 表 1PCR反应使用的引物序列 扩增片段大小 物种 目标基因 引物名称 序列 bp 18S rRNA Forward 5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3 内参基因 180 基因 Reverse 5'-biotin-TGCTGGCACCAGACTTGC-3' Forward 5'-ACCGTAGGAATAGACGTG-3' 猪 cor1 154 Reverse 5'-biotin-TGAAGCCCAGAGCTCATAG-3' Forward 5'-TTACAACAATTATCAACATAA-3 黄牛 corl 174 Reverse 5'-biotin-CCGGGTCGAAGAAGGTTGTA-3 Forward 5'-GGCCTATACTATGGATCATATAC-3' 羊 cytb 159 Reverse 5'-biotin-AATTGCTGAAAGGAGGTTGGT-3' Forward 5'-CCACCTCACCTTCCTACAC-3 鸡 cytb 77 Reverse 5'-biotin-GAAATGGAATTTTGTCA-3' 2 GB/T 35917—2018 表1(续) 扩增片段大小 物种 目标基因 引物名称 序列 bp Forward 5-GAAACTGGCTCCAACAAC-3 兔 cytb 96 Reverse 5'-biotin-AAGGAAACCTAGGGTGTCTTTG-3 Forward 5'-GGAGCAACGGTCATTACAAA-3' cytb 134 Reverse 5'-biotin-GGTAGAATAAAGTGGAAGGCAA-3 Forward 5'-GTCATCTCAGCACTAGCAG-3 貂 cytb 107 Reverse 5'-biotin-TAGGGGTGAAAGGGGATTT-3' Forward 5′-TTTGCCCACTGATTCCCCTT-3' 狐 cor1 93 Reverse 5'-biotin-CATGTTCACCCCTACGAATAT-3" Forward 5'-ACATACGAAAAACACACC-3' 鼠 cytb 107 Reverse 5'-biotin-TCCTAGAAGGGACCCAA-3 Forward 5'-CTAACAACACACATCCCCAA-3' 耗牛 D-loop 176 Reverse 5'-biotin-TTATGTACGATTAATAATT-3' Forward 5'-ACAGAAGGAAACCGAA-3' 鸭 ATPase 6 180 Reverse 5'-biotin-TCCGATGATCACGTGGAGTCC-3 5.3 阳性寡核苷酸单链DNA序列 阳性寡核苷酸单链DNA序列应与阳性对照核酸探针（PC)序列互补，5’端带生物素（biotin）标记 浓度为10μmol/L，用于膜芯片杂交过程质量控制。序列如下： GGATGC-3' 5.4 探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。 表2 目标基因探针序列 名称 序列 18SrRNA基因 5'-AminolinkerC6-AAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAAT-3' 猪 5'-AminolinkerC6-GAGCATACTTTACATCTGCCACAATAATCATTGCTATTCCC-3 黄牛 5'-AminolinkerC6-AACCCCTCTATTCGTATGATCCG-3' 羊 5'-AminolinkerC6-TGGATCATATACCTTCCTAGAAACATG-3 鸡 5'-AminolinkerC6-CCTAGGCATCTCATCCGACTC-3' 免 5'-AminolinkerC6-ACAACCCCACAGGAATTCCTTCAAAC-3" 5'-AminolinkerC6-ATCGGTACTACGCTCGTCGAATGAATC-3' 貂 5'-AminolinkerC6-GGAATCCCATCTGATTCAGAC-3 3 SAG GB/T35917—2018 表2（续） 名称 序列 狐 5'-AminolinkerC6-GGGCTACACCCTAAATGACACCTG-3 鼠 5'-AminolinkerC6-AAAATTATTAACCACTCAT-3' 耗牛 5-AminolinkerC6-CCATGCATATAAGCAAGTACATAA-3 鸭 5'-AminolinkerC6-ACCGCCCTACAAGCAATAGAGTACCATG-3' 5'-AminolinkerC6-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGT PC GTCCAAAGTACCAG-3 5'-AminolinkerC6-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGAT NC CCTATTTTC-3 5.5 其他试剂 5.5.1 蛋白酶K(ProteinaseK),20mg/mL。