ICS 67.120.10 B 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 35024—2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法 Detection method of mammals and poultry ingredients- Suspended bead array 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35024—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421)提出并归口。 和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王娉、张舒亚 高宏伟。 GB/T35024—2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法 1范围 本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法。 本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反鱼动物成分，和13 种常见肉品或掺杂成分（骆驼、马、驴、耗牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠）动物物种成分的定 性检测。方法的最低检出限为（质量百分比）：水牛5%，哺乳、反、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%，骆驼、 耗牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T3561国境口岸卫生监督食品采样、送样规程 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 液相芯片技术 suspended bead array 通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种 目标成分进行同时检测。 3.1.2 液相芯片探针 suspended array probe 固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子。 3.1.3 质控探针qualitycontrolprobe 用来监控芯片反应是否正常的探针。 注：本标准使用的是人工合成的一段寡核苷酸探针（polyT2opolyA20，5'端氨基标记）。 3.1.4 荧光强度中位值 median fluoresence intensity 液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值 校正后得到的数值。 1 GB/T35024—2018 3.1.5 阅值cutoffvalue 判定阳性信号的最低荧光强度中位值。通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时 保证灵敏度需求。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate) dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） bodiimade] EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid) MES2-吗啉乙磺酸[2-（N-morpholino)-ethanesulfonicacid] SA-PE：链霉亲和素-藻红素（streptavidin-phycoerythrobilin） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu) TE：由Tris和EDTA配制而成的缓冲溶液（Tris-EDTAbuffersolution） TMAC:四甲基氯化铵（tetramethylammoniumchloride） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane] 4方法提要 对样品中的靶基因进行PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合，采用流 式细胞技术对目标成分进行检测。每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针，特异结合一种目标 核酸序列。该核酸序列连接荧光标记物。单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束 激光检测微球的色标编码，另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物。检测单一成分时，将该成分 PCR产物与相应微球进行反应；检测多种成分时，可以将各个成分的PCR产物与微球混合物进行反 应。检测实验室需达到GB/T27403一2008的要求。 5检测用引物和探针 质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针 序列参见附录A中表A,1。 6试剂 6.1TaqDNA聚合酶。 6.210XPCR缓冲液。 6.3dNTPs (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)。 6.4琼脂糖。 2 GB/T35024—2018 6.5溴化乙锭。 6.6 酚。 6.7 三氯甲烷。 6.8异丙醇。 6.9无水乙醇。 6.10异戊醇。 6.11分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段≤2000bp）。 6.12 TE缓冲液(1o mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1 mmol/L EDTA)。 6.13电泳缓冲液（10XTBE：Tris54g，硼酸27.5g,20mL0.5mol/LEDTA·Tris-HCl.pH8.0.加水 至1000mL;50XTAE:Tris242g,100mL0.5mol/LEDTA,pH8.0.冰Z酸,57.1mL,加水至1L)。 6.14加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）。 6.15非磁性微球（微球直径5.6um，羧基修饰，按比例掺入660nm和730nm两种分类荧光染色，每 种荧光有10种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种）。 6.160.1 mol/L MES溶液 6.17EDC溶液(10mg/mL)。 6.18 30.02% Tween-20。 6.19 0.1% SDS。 6.20SA-PE溶液。 6.21TMAC溶液（5mol/LTMAC,20%N-月桂酰肌氨酸,1mol/LTris-HCl,pH8.0,0.5mol/L EDTA,pH 8.0). 6.22 CTAB 提取液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Naz EDTA,pH 8.0)。 6.23 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。 仪器设备 SAC 7.11 PCR 仪。 液相芯片仪。 7.3 恒温箱。 7.4 离心机：离心力15000g。 7.5 微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL200μL200μL~1000μL。 7.6 核酸蛋白分析仪。 7.7 天平：感量0.01mg。 8样品采集与制备 8.1样品采集与前处理 采样、送样要求应符合GB/T14699.1和SN/T3561的规定。按照8.1～8.2进行前处理，处理后的 样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样。 8.2 2肉、皮张、内脏等 先依次用70%乙醇和ddH，0冲洗2次～3次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干 净50mL离心管或干净密封袋中，冻存于一20℃。 8.3乳、饲料等 混匀后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于一20℃或4℃。 3 GB/T35024—2018 9检验步骤 9.1DNA提取 称取1g～2g处理好的样品于50mL离心管中，加人2mL～5mLCTAB提取液，加人20uL~ 100uL的20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必 要时再加入适量CTAB提取缓冲液。室温12000g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入等 体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）颠倒混匀，室温12000g转速下离心10min。转移上清 10min转移上清至干净离心管中：加人等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h。加入0.8倍体积 10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人 50μL～100μL灭菌双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模 板 DNA。 9.2DNA定量 取10uLDNA溶液加蒸留水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当OD260/ODz80比值在1.7～2.1之间时， 适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至约5ng/μL～50ng/uL。 ....(1) 1000 式中： c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL)； A———260nm处的吸光值； N一核酸稀释倍数。 9.3PCR扩增 9.3.1 PCR体系 反应体系