ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T41699—2022 兽用生物制品外源支原体检验方法 Detection of mycoplasma contamination in veterinary biological product 2023-05-01实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41699—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（SAC/TC374）提出并归口。 本文件起草单位：中国兽医药品监察所。 本文件主要起草人：罗玉峰、沈青春、孟杰、郑存哲、曲鸿飞、王芳、刘博、耿仁浩、魏津、马欣、王德丽、 肖璐、陈冬阳。 1 GB/T41699—2022 引言 当前我国兽用活疫苗制品的支原体检验方法存在检测周期长、检测结果受培养基质量影响较大等 问题。本文件参考现行《中国兽药典》《中国药典》等收录的生物制品支原体检验方法，结合生物信息技 术研究制定了支原体检测聚合酶链式反应（PCR）的检验方法，并对支原体检验培养法进行了改进。本 文件的制定可以规范我国兽用生物制品的生产和检验中的支原体检验。 GB/T41699—2022 兽用生物制品外源支原体检验方法 1范围 本文件描述了用聚合酶链式反应（PCR）法、培养法检验兽用生物制品外源支原体的原理、方法和综 合判定。 本文件适用于兽用生物制品中外源支原体的检验 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 支原体 mycoplasma 种类似细菌但无胞壁、直径50nm~300nm、能通过细菌滤器的原核微生物 注：支原体是能在人工培养基上独立生长繁殖的结构最简单的微生物，能通过细菌滤器，是引起兽用生物制品污染 的重要微生物。 3.2 16SrRNA基因 16S rRNA gene 细菌细胞内编码rRNA相对应的DNA序列。 4原理 通过物理和化学方法使样品脱氧核糖核酸（DNA）从各组分中分离出来，利用苯酚、三氯甲烷（氯 仿）、异戊醇等除去样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其他次生代谢物，然后采用乙醇沉淀和洗涤核酸样品， 获得纯化的DNA。对现有已公布支原体种类的16SrRNA基因序列进行分析，设计能够检测支原体及 留原体的通用引物，建立兽用生物制品产品及细胞的外源支原体检验聚合酶链式反应（PCR）方法。 使用支原体培养基，通过分离培养的方法，对可能污染支原体的兽用生物制品产品及细胞进行人工 培养，再通过是否有支原体生长，判断样品是否存在支原体污染 5支原体检验聚合酶链式反应（PCR）法 5 5.1试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1.1平衡酚：配制按照附录A中A.1.1的方法。 5.1.3电泳缓冲液（TAE)：配制按照A.2的方法 1 GB/T41699—2022 5.1.4Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液·pH8.0）：配制按照A.3的方法。 5.1.56倍浓缩样品缓冲液：配制按照A.4的方法。 5.1.6 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：配制按照A.5的方法。 5.1.7 1.0%琼脂糖凝胶：配制按照A.6的方法 5.1.8 细菌DNA提取试剂盒，选用前应对其核酸提取能力进行试验验证。 5.1.9DNA聚合酶（taq）及配套缓冲液（10XBuffer）或DNA聚合酶预混液（TaqMix）。 5.1.10 DNA标准分子量Marker：能够清楚地区分50bp~1000bpDNA片段 5.1.11 脱氧核糖核苷酸（dNTPs）混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种 脱氧核糖核苷酸等体积混合或直接购买市售dNTPs混合溶液 5.1.12 支原体检验通用引物：引物序列应符合附录B中B.1。 5.1.13 支原体检验阳性对照：支原体种类应符合B.2。 5.2 仪器设备 5.2.1 高速台式离心机，最高可达12000g。 5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）仪 5.2.3 生物安全柜。 5.2.4 核酸电泳仪。 5.2.5小型电泳槽。 5.2.6 凝胶成像仪。 5.3 样品DNA的抽提与纯化 5.3.1 总体要求 样品的DNA提取可采用酚氯仿抽提法（5.3.2）、细菌DNA提取试剂盒法（5.3.3）和简易提取法 （5.3.4），其中简易提取法只适用于冻干样品。阳性对照样品和阴性对照样品的DNA提取应与待检样 品的DNA提取方法一致。 5.3.2酚氯仿抽提法 在生物安全柜（5.2.3）内，取1.0mL生物制品样品或用PBS（5.1.6）复溶样品置2.5mL离心管中， 加人0.5mL平衡酚（5.1.1），颠倒振摇2min后8000g离心2min，取上清加人0.5mL苯酚：氯仿：异 一15℃以下沉淀1h，10000g离心10min弃上清，加入1.0mL75%乙醇洗涤一次后晾干，加入去离子 水50μL溶解DNA，置一15℃以下冻存。 5.3.3细菌DNA提取试剂盒法 选择经验证的市售商品化细菌DNA提取试剂盒（5.1.8），取1.0mL样品经10000g离心10min 后取沉淀，用试剂盒提取的样品DNA，终体积为50μL。 5.3.4简易提取法 取冻干样品使用TE缓冲液（5.1.4）恢复体积后，取2.0mL，10000g离心10min，弃上清，再加入 1.0mlTE缓冲液（5.1.4）重悬，10000g离心10min，弃上清，加入50μLTE缓冲液（5.1.4）重悬，沸水 浴10min，10000g离心5min取上清，置一15℃以下冻存。 2 GB/T41699—2022 5.4试验步骤 5.4.1聚合酶链式反应(PCR）扩增 将各反应小管、阴性对照管和阳性对照管标记后，按照表1所列的反应体系添加样品DNA模板 （5.3）、阳性对照（5.1.13）DNA模板、阴性对照和各试剂组分，充分混匀后，放人聚合酶链式反应（PCR） 仪（5.2.2）内，设定热盖温度98℃~102℃，95℃预变性5min后.94℃/30s，56℃/30s，72℃/40s，共 35个循环，72℃延伸5min。 表1聚合酶链式反应(PCR)检测反应体系 单位为微升 体积 试剂 普通聚合酶链式反应(PCR)试剂 TaqMix类聚合酶链式反应（PCR）试剂 DNA模板（5.3） 2.0 2.0 10μmol/L上游引物MF1(5.1.12) 1.5 1.5 10μmol/L上游引物MF2（5.1.12) 0.5 0.5 10μmol/L下游引物MR（5.1.12） 2.0 2.0 10×Buffer(5.1.9) 2.0 2.5 mmol/L dNTPs(5.1.11) 2.0 10.0(2×Tag Mix)(5.1.9) 5U/μLTaq(5.1.9) 0.5 超纯水 9.5 4.0 总体积 20.0 20.0 5.4.2 电泳 5.4.2.1将1.0%琼脂糖凝胶（5.1.7）加热熔化，灌入配套的制胶板中。在电泳槽（5.2.5）中加人适量的 TAE（5.1.3），并将凝胶置人电泳槽的电泳区域，补加电泳液至凝胶刚刚没入电泳液。 5.4.2.2取5μL聚合酶链式反应（PCR）产物（5.4.1），与1μL6倍浓缩样品缓冲液（5.1.5）混合，加入到 琼脂糖凝胶上样孔中；在检测样孔的两端分别加人DNA标准分子量Marker（5.1.10）。 5.4.2.3调整电泳仪（5.2.4），以2V/cm~5V/cm电压电泳30min~40min。 5.4.2.4用紫外凝胶成像仪（5.2.6）扫描并保存图片文件，通过与DNA标准分子量Marker（5.1.10）对 比，判断聚合酶链式反应（PCR）产物中DNA分子量大小。 5.5判定标准 5.5.1对照样品结果分析 阴性对照应无特异性扩增条带，阳性对照样品应得到396bp～413bp的特异性扩增条带，表明聚 合酶链式反应（PCR）反应体系正常工作，否则重新检测。 5.5.2试样检测结果表述 5.5.2.1样品检测结果出现396bp~413bp的特异性扩增条带，表述为试样检测结果为支原体检验聚 合酶链式反应（PCR)法阳性。 3 GB/T41699—2022 5.5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）法阴性。 6 支原体检验培养法 6.1 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 6.1.1支原体检验培养法阳性对照：支原体种类及要求应符合B.2。 6.1.2改良Frey氏液体培养基：配制按照B.3的方法。 6.1.3改良Frey氏固体培养基：配制按照B.4的方法。 6.1.4支原体液体培养基：配制按照B.5的方法。 6.1.5支原体固体培养基：配制按照B.6的方法。 6.2 仪器设备 6.2.1 恒温培养箱（35℃~37℃）。 6.2.2生物安全柜。 6.2.3 CO培养箱，具有恒湿功能。 6.3# 检验用培养基的选择 6.3.1禽源细胞、禽胚组织（或组织液）制备的病毒活疫苗，使用改良Frey氏液体培养基和改良Frey氏 固体培养基进行检验。 6.4 试验步骤 6.4.1液体培养基培养 在生物安全柜（6.2.2)内，取1.0mL生物制品样品或复溶样品接种到含20mL支原体液体培养基 （6.1.2或6.1.4）的小瓶，混匀后，再从小瓶中取0.4mL移植到2支含1.8mL支原体液体培养基的小管 (1.0cm×10.0cm）