SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 27732011 国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查 方法‧属通用引物基因悬浮芯片法 Rapid simultaneous screen method for five bio-terrorism bacteria at frontier port-Gene suspension array with universal primers on genus level 行业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2773—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。 本标准主要起草人：杨宇、张晓龙、孙肖红、王惠兰、张乐、王静、杨永莉。 行业标准信息服务平台 SN/T 2773—2011 国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛香 方法属通用引物基因悬浮芯片法 1范围 本标准规定了用于国境口岸快速筛查炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis，B.a）、鼠疫耶尔森菌 (Yersinia pestis，Y.p）、布鲁菌（Brucella spp.，Bru)、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis，F.t)和 类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei，B.p）五种重要生物恐怖病原菌的基因悬浮芯片筛 查方法。 本标准适用于国境口岸发现的可疑物品或环境样品中五种重要生物恐怖病原菌的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1552国境口岸生物因子恐怖事件监测规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 行业标准 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 生物恐怖病原菌bio-terrorismbacteria 可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、 发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和 释放。 3. 2 基因悬浮芯片genesuspensionarray 利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸进行大规模测定的一种生物芯片 技术。 生物安全防护要求 4 4.1排查前做好个人防护。防护方法和标准见SN/T1552。 4.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 4.3使用过的实验用品应遵照GB19489的要求，对废弃物应进行无害化处理。 1 SN/T 2773—2011 5主要设备与试剂 5.1主要设备 悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、PCR仪、生物安全柜、移液器、核 酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。 5.2主要试剂 LB液体培养基（见A.1）、LB固体培养基（见A.2）、DSM芽孢培养基（见A.3）、PCR反应预混液 （见A.4）、氯化四甲铵（TMAC）、1.5XTMAC杂交液（见A.5）、1XTMAC杂交液（见A.6）、羧基化编 码微球、2[N-吗啉]乙磺酸（MES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、SDS、N-十二烷 乙醇、Tris饱和酚、三氯甲烷、吐温-20。 6检测方法 6.1样品采集 依SN/T1552执行。 6.2细菌DNA提取 6.2.1取0.1g样本加500μLPBS（见A.8）,1000g离心3min；取上清液，12000g离心1min，弃去上 清液。 6.2.2沉淀用PBS洗涤3次后，向每管样本中加人6mol/L碘化钠100μL，振荡混匀30s，煮沸 30min，间或混匀。 6.2.3将上述煮沸处理的样本于10000g离心5min，将上清转至另一含500μL20%玻璃粉悬液的 1.5mL离心（EP)管中。充分混匀，置室温10min，期间每2min混匀1次，使暴露的DNA吸附于玻璃 粉上。 6.2.48000g离心2min，小心倾去上清液。 6.2.5向玻璃粉DNA沉淀中加人75%乙醇1mL，充分混匀，洗涤玻璃粉，8000g离心2min，小心倾 去上清液。 干燥。 6.2.7向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20μLTE（见A.7），充分混匀，65℃加热15min，期间每 5min混匀一次。 6.2.88000g离心2min，回收上清液。用紫外分光光度法测定DNA吸光度值，确定DNA的浓度， 备用。 注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同的方法。 6.3PCR扩增 扩增引物和探针设计方法见B.1，扩增引物序列见表B.2，反应体系为50μL，其中takarapremix （见A.4）25μL，上游引物（浓度为10μmol/L）2μL，下游引物（浓度为10μmol/L）2μL，样品模板DNA 2μL水19μL。反应条件为预变性94℃10min，35个循环（94℃30s，58℃30s72℃30s），延伸 2