ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7230—2019 贝类包纳米虫病诊断规程 Code of diagnosis for bonamiosis of mollusks 行业标准信息服务平台 2019-11-01实施 2019-08-01发布 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7230—2019 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。 本标准主要起草人：杨冰、白昌明、刘莹、黄健、王崇明、李清、万晓媛、史成银、李晨、辛鲁生、余卫忠。 行业标准信息服务平台 I SC/T7230—2019 贝类包纳米虫病诊断规程 1范围 本标准给出了贝类包纳米虫病（bonamiosis)诊断所需试剂和材料、器材和设备，规定了采样、PCR检 测和综合判定的要求。 本标准适用于贝类样品中牡蛎包纳米虫（Bonamiaostreae）和杀蛎包纳米虫（Bonamiaeritiosa）感染 的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SC/T7205.1牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法 SC/T7205.2牡蛎包纳米虫病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法 SC/T7205.3牡蛎包纳米虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对(basepair) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） EB：溴化乙啶（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸（sodiumdodecyl sulfate) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris·HCI) Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane) 4试剂和材料 意服务平台 4.1除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水。 4.2无水乙醇：分析纯。 4.3TE缓冲液按附录A中A.1的规定执行。 4.4抽提缓冲液按附录A.2的规定执行。 4.5蛋白酶K按附录A.3的规定执行。 4.610mol/L乙酸铵按附录A.4的规定执行。 4.7Tirs饱和酚（pH≥7.8)：分析纯。 4.8酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯。 4.9氯仿/异戊醇（24：1)：分析纯。 4.101X电泳缓冲液按附录A.5的规定执行。 4.1170%乙醇按附录A.6的规定执行。 4.12dNTP（各2.5mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物， 1 SC/T 7230—2019 一20℃保存，用于PCR。 4.1310XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg2+离子，随TagDNA聚合酶提供，一20℃保存。 4.14MgCl（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。 4.15 TaqDNA聚合酶（5U/uL）：生化试剂，一20℃保存。 4. 16 正向引物Bo（10 μmol/L):5'-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3'，一20℃保存。 4. 17 反向引物 Boas （10 μmol/L):5'-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3',一20℃保存。 4.18 阳性对照：已知受牡蛎包纳米虫或杀蛎包纳米虫感染的贝类组织样品，一70℃保存。 4. 19 阴性对照：已知未受牡蛎包纳米虫或杀蛎包纳米虫感染的贝类组织样品，一70℃保存。 4.20 PCR检测空白对照为灭菌双蒸水 4.21 琼脂糖。 PUBL 4. 22 DNA分子量标准。 4.23 器材和设备 Q 5.1 PCR仪。 5.2电泳仪。 5.3水平电泳槽。 5.4紫外观察仪或凝胶成像仪 RA 5.5高速冷冻离心机 5.6水浴锅或金属浴 5.7普通冰箱。 5.8 一80℃超低温冰 5.9电炉或微波炉 5. 10 微量移液器：量利 0.5ul 0mL2 6 采样 6.1采样对象 类包纳来 牡蛎等易感双壳贝类 6. 2 采样数量、方法和保存运辅 应符合SC/T7205.1的要 6.3样品的采集 取闭壳肌和消化腺。 稚贝（附着后至2mm）和幼贝（2mm 取内脏团：成贝 样品采集后分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于一20℃的冰箱中。 7PCR检测 7.1DNA的提取 7.1.1取30mg~50mg组织样品，加入抽提缓冲液500μL，充分研磨，37℃温浴1h。提取过程中同时 设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 7.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100μg/mL，混匀后置于50℃水浴3h，不时旋动。 7.1.3将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min，于10000r/min离心3min分离两相。 10000r/min离心1min分离两相。 2