ICS 65.020.30 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7231—2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程 Code of diagnosis for marteiliosis of mollusks 行业标准信息服务平台 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7231—2019 VO 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。 本标准主要起草人：白昌明、杨冰、温智清、王崇明、黄健、李清、万晓媛、史成银、李晨、辛鲁生、余卫忠。 行业标准信息服务平台 1 SC/T 7231—2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程 1范围 PCR检测和综合判定的要求。 本标准适用于贝类样品中折光马尔太虫（Marteiliarefringens）感染的流行病学调查、诊断、检疫和监 测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SC/T7205.1牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法 SC/T7207.1牡蛎马尔太虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法 SC/T7207.2牡蛎马尔太虫病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法 SC/T7207.3牡蛎马尔太虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） EB：溴化乙啶（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate） Taq：水生栖热菌（Thermusaguaticus） TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTATris·HCI) Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 4试剂和材料 4.1除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水 4.2无水乙醇：分析纯。 4.3TE缓冲液的配制按附录A中A.1的规定执行。 4.4抽提缓冲液的配制按附录A.2的规定执行。 4.5蛋白酶K的配制按附录A.3的规定执行。 4.610mol/L乙酸铵的配制按附录A.4的规定执行。 4.7Tirs饱和酚(pH≥7.8)：分析纯。 4.8酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)：分析纯。 4.9氯仿/异戊醇（24：1)：分析纯。 4.101×电泳缓冲液的配制按附录A.5的规定执行。 4.1170%乙醇的配制按附录A.6的规定执行。 SC/T 7231—2019 4.12dNTP（各2.5mmol/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物 -20℃保存，用于PCR。 4.13 310XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg?+离子，随TaqDNA聚合酶提供，一20℃保存。 4.14MgClz（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。 4. 15 TaqDNA聚合酶（5U/μL）：生化试剂，一20℃保存。 4.16 正向引物Pr4(10 μmol/L):5'-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3',-20℃保存。 4. 17 反向引物Pr5（10μmol/L）：5'-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3，一20℃保存。 4. 18 阳性对照：已知受折光马尔太虫感染的 一70℃保存。 4. 19 阴性对照：已知未受折光马尔太虫感染的贝类组织样品， ℃保存。 4.20 PCR检测空白对照为灭菌双蒸本 4. 21 琼脂糖。 4.22 DNA分子量标准 ARD 4.23 10mg/mL澳化乙 品 5 器材和设备 5. 1 PCR仪 5. 2 电泳仪 5.3 水平电 5. 4 紫外观 5. 5 高速离心 5. 6 水浴锅或 5. 7 普通冰 5. 8 -80℃ 5. 9 电炉或微 5. 10 微量移液器 μL. 6 采样 K 6.1 采样对象 牡蛎等易感双壳贝 贝类折 6.2采样数量、方法和保存运辅 应符合SC/T7205.1的要 6.3样品的采集 稚贝（附着后至2mm）和幼贝（2mm~3cm）取内脏团；成贝（>3cm）取胃、肠道、消化腺和闭壳肌。 样品采集后分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于一20℃的冰箱中。 7PCR检测 7.1DNA的提取 7.1.1取30mg~50mg组织样品，加人抽提缓冲液500μL，充分研磨，37℃温浴1h。提取过程同时设 置阳性对照、阴性对照。 7.1.2加人2.5uL20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100μg/mL，混匀后置于50℃水浴3h，不时旋动。 7.1.3将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min，于10000r/min离心3min分离两相。 7.1.4水相移至新的1.5mL离心管中，加人等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混合10min，于 2