ICS 67.060 B 20 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T26625—2011 粮油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法 Inspection of grain and oilsDetermination of soybean isoflavone- High performance liquid chromatography 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 26625—2011 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、九三粮油工业集团有限公司。 本标准主要起草人：高勇、杨长志、李铁柱、张洪祥、邓立育、王乐、丁丽莎。 1 GB/T26625—2011 粮油检验大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法 SAG 1范围 本标准规定了高效液相色谱法测定大豆异黄酮（天豆武、黄豆黄素、染料木武、大豆黄素、黄豆黄素 试元、染料木素）含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示、精 密度的要求 本标准适用于大豆、豆奶粉、豆豉中大豆异黄酮含量的测定。 本标准测试方法的最低检测限为2.5mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取，提取液经离心、浓缩、定容、过滤，用高效液相色谱仪测定，外 标法定量。 4试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇。 4. 3 乙酸。 4.4 90%甲醇溶液：取900mL甲醇，加入100mL水，混匀。 4.5 60%甲醇溶液：取600mL甲醇，加人400mL水，混匀。 4.6 10%甲醇溶液：取100mL甲醇，加人900mL水，混匀。 4.7 4.8 0.1%乙酸乙腈溶液：取1mL乙酸，置于1000mL容量瓶中，用乙睛溶解并定容至刻度。 4.9大豆武（daidzin）：纯度不低于98%。 4.10 染料木武（genistin）：纯度不低于99%。 4.11大豆黄素（daidzein）：纯度不低于98%。 4.12染料木素（genistein）：纯度不低于98%。 4. 13 黄豆黄素（glycitin）：纯度不低于98%。 4.14黄豆黄素武元（glycitein）：纯度不低于98%。 4.15标准储备溶液配制： 黄素、黄豆黄素武元标准品，分别用60%甲醇（4.5）配成浓度为1mg/mL的标准储备溶液。一18℃避 1 GB/T26625—2011 光保存，有效期6个月。 4.15.2大豆异黄酮混合标准中间溶液：分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液（4.15.1） 0.5mL于同一10mL容量瓶中，用60%甲醇（4.5）定容至刻度，配制成各组分浓度为50μg/mL的大 豆异黄酮混合标准中间溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期3个月。 上述大豆异黄酮混合标准中间溶液（4.15.2）于10mL容量瓶中，用10%甲醇（4.6）溶液配成各组分浓 度0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL、5.00μg/mL系列的大豆异黄酮混合标准工 作溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期一周。 4.16滤膜：0.45μm。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。 5. 2 分析天平：感量0.01mg、感量0.01g。 5. 3 旋转蒸发器。 5.4 超声波清洗器：50W。 5.5 离心机：10000r/min。 5.6 粉碎机。 5.7 组织捣碎机。 5.8浓缩瓶：250mL。 5.9样品筛：孔径2.0mm。 6试样制备与保存 6.1试样制备 6.1.1大豆 取有代表性样品约500g，用粉碎机（5.6）粉碎使其全部通过孔径2.0mm样品筛（5.9），混匀，装人 洁净容器作为试样，密封备用。 6.1.2豆豉 取有代表性样品约500g，用组织捣碎机（5.7）捣碎，混匀，装人洁净容器作为试样，密封备用。 6.2试样保存 粉碎试样于4℃以下保存。试样制备过程中，应防止样品污染或组分变化。 7操作步骤 7.1提取 称取5g（精确到0.01g）试样于250mL具塞三角瓶中，加90mL90%甲醇溶液（4.4），置于超声波 清洗器（5.4)中60℃提取30min，在离心机（5.5）中10000r/min离心10min，上清液转移至250mL 浓缩瓶（5.8）中，残渣再加入60mL90%甲醇溶液进行提取，上清液也转入250mL浓缩瓶，在旋转蒸发 器（5.3)60℃浓缩至约40mL。浓缩液转人50mL容量瓶，用10%甲醇溶液（4.6）冲洗浓缩瓶并定容 至刻度。取1mL提取液通过0.45μm滤膜（4.16），供高效液相色谱仪测定。 7.2色谱参考条件 色谱参考条件如下： a)1 色谱柱：RPCs柱（250mmX4.6mm，5μm）或性能相当的色谱柱； b) 流动相：0.1%乙酸溶液（4.7）和0.1%乙酸乙睛溶液（4.8），按表1的规定进行梯度洗脱； c） 流速：1.0mL/min; 2 GB/T26625—2011 柱温：40℃； e) 波长：260nm； f) 进样量：20μL。 表1梯度洗脱表 时间/min 0.1%乙酸水溶液/mL 0.1%乙酸乙腈溶液/mL 0 90 10 12.5 70 30 17. 5 60 40 18.5 0 100 21.0 0 100 22.5 06 10 26.0 90 10 7. 3 测定 参考上述色谱条件(7.2)调节高效液相色谱仪，使大豆异黄酮各组分的色谱峰完全分离。分别吸取 20μL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液（4.15.3）和样液（7.1）进行液相色谱测定，分别得到大豆 异黄酮各组分的标准工作液峰面积（A，）和样液大豆异黄酮各组分峰面积（A，）。如果样液中大豆异黄 酮某一组分峰面积与标准工作溶液中的该组分峰面积相差较大时，稀释样液或调整标准工作液浓度后 再行测定。 在上述色谱条件下，大豆异黄酮各组分的保留时间约为：大豆8.2min、黄豆黄素8.8min、染料 木式11.0min、大豆黄素15.3min、黄豆黄素式元16.3min、染料木素19.4min。标准品的色谱图参见 附录A。 7.4空白试验 除不加试样外，按7.1～7.3操作步骤进行测定。 8结果计算与表示 8.1大豆异黄酮各组分含量 按式（1）计算试样中大豆异黄酮各组分含量（mg/kg）。 ·(1) AsiXm 式中： 试样中某一大豆异黄酮组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A, 试样提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积； A.i 大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积； 大豆异黄酮混合标准液中某一组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V—试样提取液最终定容体积，单位为毫升（mL）； 试样质量，单位为克（g）。 m 注：计算结果应扣除空白值。 8.2大豆异黄酮总含量 试样大豆异黄酮总含量为各组分之和，按式（2）计算： X-EX ..(2) 3