ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27621—2011 马鼻肺炎病毒PCR检测方法 Protocol of PCR for equine rhinopneumonitis virus 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27621—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：新疆农业大学。 本标准主要起草人：冉多良、单文鲁、马伟、王传锋、张伟。 1 GB/T 27621—2011 马鼻肺炎病毒PCR检测方法 1范围 本标准规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法。 本标准适用于马匹的流通和进出境检疫实施马鼻肺炎的现场检疫和后续监管工作。一步法PCR 检测技术适用于实验室细胞毒样品检测；巢式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EHV：equinerhinopneumonitis，马传染性鼻肺炎。 RNA：ribonucleic acid,核糖核酸。 CPE：cytopathiceffect，细胞病变。 EB：ethidiumbromide，溴化乙锭。 EDTA:ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 SDS：sodiumdodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠。 BHK-21:baby hamsterkidney cell,仓鼠幼肾细胞 PBS:phosphatebuffersodium，磷酸盐缓冲液 4试剂和材料（试剂不经注明，均为分析纯） 4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格， 4.2 RNA酶A。 4.3 酚-三氯甲烷。 4. 4 2%琼脂糖凝胶：见A.1。 4.5 溴化乙锭（10μg/μL）：见A.2。 4.6 DNA聚合酶（5 U/μL)。 4.7 50XTAE电泳缓冲液（pH8.5）：见A.3。 4.8 10 XPCR Buffer (plus Mg²+)。 4.9 2.5 mmol/mL dNTP. 4.10 蛋白酶K(20 mg/mL）。 4. 11 BHK-21 细胞。 4.12 含2%特牛血清的MEM维持液。 1 GB/T 27621—2011 4.13 0.3mol/L乙酸钠。 4.14 0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2):见 A.4。 4.15 SDS。 4.16 10×TE缓冲液（pH8.0):见A.5。 4.17 无水乙醇。 4.18 70%乙醇。 4.19 Tris饱和酚(pH8.0)。 4.20 分子质量标准DL2000。 5 器材和设备 5. 1 低温冷冻高速离心机。 5. 2 倒置显微镜。 5. 3 CO，恒温培养箱。 5. 4 普通冰箱和超低温冰箱。 5.5 组织研磨器。 5.6 1.5mL离心管。 5.7 PCR扩增仪。 5.8 水平电泳槽。 5. 9 微量移液器及吸头。 5.10 紫外照射仪或凝胶成像仪。 6 EHV的分离 6.1采样 取马流产胎儿病料的肺、脾或淋巴组织，疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根 6.2样品处理 组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液置于组织研磨器中研磨匀浆，反复冻融3次；鼻咽拭 子3根在2mL0.01mol/LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。 6.3病毒增殖 将毒种接种到单层的BHK-21细胞上，37℃吸附1h，加适量含2%的牛血清的MEM维持液， CO2恒温培养箱37℃静置培养，利用倒置显微镜逐日观察CPE，48h后当CPE达85%以上时收毒，冻 存于一70℃冰箱备用。 EHV的PCR检测 7.1样品处理 组织样品2g与2mL0.01mol/LPBS缓冲液研磨匀浆，反复冻融3次；鼻咽拭子3根在2mL 0.01mol/LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。 GB/T 27621—2011 7.2核酸抽提 取适当病料或细胞毒0.5mL，加人RNA酶A至终浓度为100μg/mL，37℃作用30min；加人 20mg/mL蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，SDS终浓度为0.5%。在56℃水浴内反应60min至反应 物清亮，期间不断轻摇溶液。加等体积TE饱和酚，轻摇20min，12000r/min离心7min；取水相加等 体积酚-三氯甲烷（1：1），轻摇20min，12000r/min离心7min；取水相加等体积三氯甲烷，轻摇 15min，12000r/min离心7min；收集水相。在上述水相中加入2.5倍体积预冷的无水乙醇和终浓度 为0.3mol/L乙酸钠，一20℃放置20min。12000r/min离心10min，使核酸沉淀，弃去上清液。立刻 加入70%乙醇，将沉淀漂洗2次，以去除残留的盐类。倾去乙醇，倒置在滤纸上干燥，然后加0.5mL TE(pH8.0)，于4℃冰箱内过夜溶解DNA。37℃干燥20min或抽真空干燥；最后加10μL水溶解 后，作为PCR模板。 7.3以引物F、引物F1c和引物F4c(参见B.1)为条件的体系 含1.5mmol/LMgClz的10XPCRBuffer5μL；2.5mmol/L的dNTP4μL；引物F、引物F1c和 引物F4c（参见B.1)各1μL；模板DNA1μL；DNA聚合酶0.5μL加双蒸水至50μL，然后将上述成 分混合均匀。在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应条件为94℃预变性4min，30次如下循环：94℃ 1min,56℃1min,72℃1min,最后72℃延伸7min。 取10uLPCR扩增产物，加2L6×加样缓冲液，在含有漠化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2o00Marker作分子质量标准比 较：EHV-1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段。空白对照在311bp和 468bp没有核酸带（参见附录C)。 7.4巢式PCR扩增方法 7.4.1以引物Fz和引物Fc[参见B.2a)]为条件的体系如下： 一含1.5mmol/LMgClz的10XPCRBuffer5μL;2.5mmol/L的dNTP4μL;引物Fz和引物 FcL参见B.2a）各1μL；模板DNA1μL2.5UDNA聚合酶0.5μL；加双蒸水至50μL，混合 均匀，瞬时离心后，放入PCR仪中。PCR反应程序为94℃预变性4min，25次循环（94℃变 性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min），取出PCR反应产物； 取10μLPCR扩增产物，加2μL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳 30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2o00Marker作分子质 量标准比较（标准EHV-1和EHV-4会出现747bp的DNA片段，空白对照在747bp没有 DNA片段，参见图D.1)。 7.4.2↓ 巢式PCR第二次反应：待扩增病毒DNA为1OO倍稀释的一次扩增PCR产物作为二次扩增模 板。以引物F1和引物F1c[参见B.2b)]为条件的体系如下： 一含1.5mmol/LMgCl2的10XPCRBuffer5μL；2.5mmol/L的dNTP4μL;引物F1和引物 F1c[参见B.2b)各1μL；模板DNA1μL2.5UDNA聚合酶0.5μL；加双蒸水至50μL。然 后，将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。PCR反应条件为94℃预变性4min，25次循环 (94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min）； 30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2oo0Marker作分子质 量标准比较（标准EHV-1出现404bp的DNA片段，空白对照在404bp没有DNA片段，参见 图 D. 2)。 3