ICS 67.120 X 04 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T21323—2007 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法 Determination of aminoglycosides residues in animal tissues- HPLC-MS/MS method 2007-10-29发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21323—2007 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫 局、湖南师范大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：黄志强、林黎明、张鸿伟、张莹、陈波、彭涛、李晓娟、王美玲、颜鸿飞 GB/T21323—2007 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了动物组织中壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普 霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素10种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定和确证 方法。 本标准适用于动物内脏、肌肉和水产品中10种氨基糖苷类药物残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 丁酸作为离子对试剂，高效液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇：液相色谱级。 4.2冰乙酸：液相色谱级。 4.3甲酸：液相色谱级。 4.4七氟丁酸：纯度≥99%。 4.5浓盐酸。 4.6 氢氧化钠。 4.7 三氯乙酸：纯度≥99%。 4.8Z 乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA）：纯度≥99%。 4.9磷酸二氢钾。 4.10七氟丁酸溶液（HFBA）：100mmol/L，准确量取6.5mL七氟丁酸（4.4），用水稀释至500mL （4℃避光可保存6个月）。 4.11七氟丁酸溶液：20mmol/L，准确量取100mmol/L七氟丁酸溶液50mL（4.10），用水稀释至 250mL（4℃避光可保存6个月）。 用980mL水溶解，用1.0mol/L的盐酸调pH到4.0分别加入Na2EDTA（4.8）0.15g和三氯乙酸 （4.7）20g，溶解混匀并定容至1000mL（4℃避光可保存1个月）。 4.13甲酸：0.1%（体积分数），准确吸取1.0mL甲酸（4.3）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度， 混匀。 1 GB/T213232007 4.14壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉 素、新霉素标准品：纯度范围92.0%~99%。 4.1510种氨基糖苷类药物标准贮备液：分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品（4.14），用 水溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准贮备溶液（4℃避光可保存6个月）。 4.1610种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液：分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡 那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素标准贮备溶液（4.15）各1.0mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素标 准贮备溶液（4.15）各5.0mL，于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成壮观霉素、双氢链霉素、链 霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0ug/mL，新霉素、潮霉素B和安普霉素 4.1710种氨基糖苷类药物标准工作溶液：精密量取标准中间溶液（4.16）适量，用空白样品基质配制 成不同浓度系列的混合标准工作溶液（现用现配）。 4.18固相萃取C1s柱：500mg，3mL。 5仪器 5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5. 2 高速组织捣碎机。 5.3均质器。 5.4旋转蒸发器。 5.5氮吹仪。 5.6 pH计。 5.7 分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台。 5.8真空泵。 5.9离心机。 6试样制备与保存 6.1试样制备 样品经高速组织捣碎机均匀捣碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装人清洁容器内，加封后 作出标记，一份作为试样，一份作为留样。 6.2试样的保存 将试样于一18℃下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取约5g（精确至0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10.0mL磷酸盐缓冲液（4.12)均 质2min，于平板振荡器上振荡提取10min，离心10min（4500r/min），将上清液转移到另一个50mL 1.0mol/L的盐酸调pH值为3.5土0.2,加入2.0mL七氟丁酸溶液（4.10），涡旋混匀。 7.2净化 Cis固相萃取柱用3.0mL甲醇（4.1），3mL七氟丁酸溶液（4.11)淋洗后，将提取液加载在固相萃取 柱上，控制流速约1滴/s，先用3mL七氟丁酸溶液（4.11）淋洗，再用每次3mL水淋洗两次，弃去淋洗 液，抽干5min。用5mL乙-七氟丁酸溶液（4.11）（80十20，体积比）洗脱，收集洗脱液于精密刻度试 管中，40℃氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液（4.11)定容至1.0mL，涡旋混匀后，过0.2um微孔滤 膜，液相色谱-质谱/质谱测定。 2 GB/T 21323—2007 7.3测定 7.3.1标准工作曲线制备 制备混合标准浓度系列，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大 霉素分别为50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、l000ng/mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素 分别为300ng/ml、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL，按7.3.2条件测定并制作 7.3.2液相色谱条件 色谱柱：Cis柱（可用IntersilODS-3，粒径5μm，柱长150mm，内径4.6mm或相当者）； a) 流动相：甲醇十水十100mmol/LHFBA（梯度洗脱），流动相组成和洗脱梯度见表1； 表1 流动相组成和洗脱梯度 时间/min 甲醇/% 水/% 100 mmol/L HFBA/% 0 5 75 20 0. 5 5 75 20 1. 0 60 20 20 12. 0 70 10 20 12. 1 80 0 20 15.0 80 0 20 15. 1 5 75 20 35.0 5 75 20 c) 流速：0.3mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：30μL。 7.3.3质谱条件 参见附录A。 7.3.4液相色谱-串联质谱测定 7.3.4.1定性测定 液相比在士2.5%的允许偏差之内；待测化合物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3 （S/N≥3），定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10（S/N≥10）；定性离子对的相对丰度 与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的目标化合 物。10种氨基糖苷类药物标准工作溶液的定量离子对的重构离子色谱图参见图B.1~图B.10。 表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.3.4.2定量测定 按外标法使用标准工作曲线进行定量测定。 7.4空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 7.5结果计算 试样中每种氨基糖苷类药物残留量利用数据处理系统计算或按式（1)计算： 3