ICS 67.180. 10 X 31 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T18932.25—2005 蜂蜜中青霉素G、青霉素V、 乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、 双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of penicillin G, penicillin V, nafcillin,oxacillin ,cloxacillin, dicloxacillin residues in honey— LC-MS-MS method 2005-08-01实施 2005-02-04发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T18932.25—2005 前言 GB/118932本部分的附录A、附录B为资料性附录。 本部分由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本部分由中华全国供销合作总社归口。 本部分起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：庞国芳、李学民、张进杰、曹彦忠、范春林、刘永明、赵为、郭彤彤、石玉秋。 本部分系首次发布的国家标准。 GB/T18932.25—2005 蜂蜜中青霉素G、青霉素V、 乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、 双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 1 范围 GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉 素、双氯青霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本部分适用于蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残 留量的测定。 本部分的方法检出限：青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素为1.0μg/kg；邻氯青霉素、双氯青霉素为 2.0μg/kg；乙氧萘青霉素为0.5μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB/T6379 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性（GB/T 63791986,neqISO5725:1981) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中青霉素残留，用去离子水溶解后，溶液用OasisHLB或相当的固相萃取柱净化，液相色谱 串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3乙酸：优级纯。 4.4乙腈十水（1+3）：量取25mL乙腈（4.2)与75mL水混合。 4.5OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇（4.1)和10mL水预 处理，保持柱体湿润。 4.6青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准物质：纯度≥99%。 4.7青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准储备溶液：准确称 取适量的每种标准物质（4.6），分别用乙睛（4.4）配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。储备液贮 存在一18℃冰柜中。 4.8青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准工作溶液：根据需 GB/T18932.25—2005 要吸取适量青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素，邻氯青霉素、双氯青霉素标准储备溶液 （4.7），用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台。 5.3 液体混匀器。 5.4 固相萃取真空装置。 5.5贮液器：50mL。 5.6 微量注射器：25μL，100μL。 5.7 刻度样品管：5mL，精度为0.1mL。 5. 8 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.91 pH计：测量精度士0.02。 5. 10 氮气吹干仪。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅勾，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样 品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 将试样于常温下保存。 7测定步骤 7. 1 试样溶液的制备 称取5g试样（精确到0.01g）置于150mL三角瓶中，加入25mL去离子水，于液体混匀器上快速 混合1min，使试样完全溶解。样液移至下接OasisHLB柱（4.5）的贮液器中，以小于或等于3mL/min 的流速通过Oasis固相萃取柱后，用5mL水洗柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干 20min，最后用3mL甲醇（4.1)洗脱，收集洗脱液于刻度样品管（5.7)中，于40℃水浴中用氮气吹干仪 吹干，用乙睛（4.4）定容至1mL，摇匀后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2测定 7.2.1液相色谱条件 a) 色谱柱：SunFireTMCis3.5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相及流速见表1； c) 柱温：30℃； d) 进样量：20μL。 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/（μL/min） 水（含0.4%乙酸）/（%） 乙腈/(%) 0.00 200 60.0 40.0 15.00 200 35.0 65.0 15, 01 200 60.0 40.0 25.01 200 60.0 40.0 2 GB/T18932.25—2005 7. 2. 2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.055MPa； f) 气帘气压力：0.079MPa； g) 辅助气流速：6L/min； h) 离子源温度：400℃； i) 定性离子对、定量离子对和去簇电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞能量（CE)及碰撞室出口电压 (CXP),见表2。 定性 定量 碰撞 去簇 聚焦 碰撞室 名称 离子对/ 离子对/ 能量/ 电压/ 电压/ 出口电压/ (m/z) (m/z) V v v 335/160 20 青霉素 G 335/160 45 200 11 335/176 23 351/160 20 青霉素V 351/160 40 200 11 351/192 15 402/160 22 苯唑青霉素 45 200 402/160 11 20 402/243 436/160 22 邻氯青霉素 436/160 50 200 11 436/277 22 415/199 21 乙氧萘青霉素 415/199 45 200 11 415/256 23 470/160 21 双氯青霉素 470/160 50 200 11 470/311 21 7.2.3液相色谱-串联质谱测定 7.2.3.1定性测定 在相同试验条件下，样品中待测物质与同时检测的标准品具有相同的保留时间，并且所选择的两对 离子丰度比相一致，则可判定为样品中存在该残留。 7.2.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下，用青霉素G、青霉素V、乙氧茶青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉 素标准储备溶液配成的基质混合标准溶液（4.8)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为 纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中青霉素G、青霉素V、乙氧萘 青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 在上述色谱条件下，青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的总 离子流图参见图A.1。青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的保 留时间和离子丰度比见表3。 3