ICS 67.040 X 04 中华人民共和国国家标准 GB/T 37512—2019 粮油检验 实际与理论ECN42 甘三酯含量差值的测定 Inspection of grain and oilsDetermination of the difference between actual and theoretical content of triacylglycerols with ECN42 2019-05-10发布 2019-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 37512—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家粮食和物资储备局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC270)归口。 本标准起草单位：国家粮食局科学研究院。 本标准主要起草人：张蕊、薛雅琳、张冰。 1 GB/T37512—2019 粮油检验实际与理论ECN42 甘三酯含量差值的测定 1范围 本标准规定了油脂中实际等效碳数42（ECN42HPLC）甘三酯含量与理论等效碳数42（ECN42理论）甘 三酯含量绝对差值的测定方法。 本标准适用于橄榄油，适用于检测各类别橄榄油中是否掺有少量籽油（富含亚油酸）。 注：ECN42HPLc由高效液相色谱法测得，ECN42理论由气相色谱法测定的脂肪酸组成后计算所得。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB5009.168食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定 GB/T23347橄榄油、油橄榄果渣油 COI/T.20/Doc.No.24橄榄油和橄榄果渣油脂肪酸甲酯制备（Preparationofthefattyacid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil) 3原理 ECN42理论甘三酯含量以及其与ECN42HPLc甘三酯含量差值是通过其他方法获得的数据协同计算 得到，包括气相色谱法测定脂肪酸组成、计算理论ECN42甘三酯含量和高效液相色谱法测定ECN42 甘三酯含量。 对于真实橄榄油，由高效液相色谱法测得的实际ECN42甘三酯含量与由气相色谱法测得的脂肪 酸组成计算得到的理论ECN42甘三酯含量差值应在某一界限内。当差值大于相应等级橄榄油规定值 则表明橄榄油中含有籽油。 4 仪器设备 4.1圆底烧瓶：250mL和500mL。 4.2 烧杯：100mL。 4.3 玻璃色谱柱：内径21mm，长450mm，配有旋塞，上端口为标准内磨口。 4.4 分液漏斗：250mL，底部为标准外磨口，与玻璃色谱柱上端口配套 4.5 玻璃棒：长600mm。 4.6 玻璃漏斗：直径80mm。 4.7 容量瓶：50mL。 4.8 容量瓶：20mL。 4.9旋转蒸发器。 4.10 高效液相色谱：配有柱温温控装置 1 GB/T37512—2019 4.11 注射器：10μL。 4.12检测器：示差折光检测器。最高灵敏度折光指数至少是10-4。 4.13不锈钢色谱柱：柱长250mm，柱内径4.5mm，填料粒径5um，含碳22%~23%十八烷基键合硅 胶。柱效宜确保三油酸甘油酯与邻近保留时间的甘三酯色谱峰分离良好。 4.14样品瓶：2mL，带孔旋盖（Teflon垫）。 5试剂 除另有说明外，所用试剂均为分析纯 5.1石油醚：40℃~60℃，色谱纯，或正已烷 5.2 乙醚：无过氧化物，新蒸馏。 5.3 3洗脱液：用于柱色谱纯化油脂，石油醚：乙醚=87：13（体积比）。 5.4硅胶：70目~230目，Merck7734，含水量5%（质量分数）。 5.5玻璃棉。 5.6丙酮：色谱级。 5.7乙腈或丙腈：色谱级 5.8流动相：乙睛十内酮（可调节两者比例获得满意分离效果；初始50：50）或内。应脱气，并可能需 多次脱气直至不影响分离。 5.9溶剂：丙酮。 5.10甘三酯参考物质：商品化甘三酯（三棕榈酸甘油酯、三油酸甘三酯等），根据等效碳数确定保留时 间；或参考附录A中低亚油酸橄榄油（橄榄油）、高亚油酸橄榄油（混有籽油的橄榄油）的液相色谱图（参 见图A.1、图A.2）。 注1：洗脱顺序可由计算的等效碳数确定，等效碳数（ECN)定义为ECN=CN-2n，其中CN为碳数，n为双键数；若 考虑双键来源，计算等效碳数更加精确。如no、ni、nLn分别是油酸、亚油酸和亚麻酸双键个数，等效碳数可依 据下式计算： ECN-CN-dono-dini-dini 其中系数d。、d，和dL.可由甘三酯参考物质计算得到。在本标准规定条件下，关系式近似于： ECN=CN-2.60no-2.35n-2.17nLn 注2：计算几种甘三酯参考物质相对于三油酸甘油酯的选择因子： α=RT'/RT三油酸甘油酶 其中调整保留时间RT-RT-RT游 5.11固相萃取柱(SPE)：硅胶1g,6mL 6操作步骤 6.1试样制备 6.1.1纯化必要性 为避免干扰物质引起假阳性结果，样品应进行纯化 6.1.2传统柱色谱纯化 6.1.2.1色谱柱的制备 向色谱柱（4.3）中加入30mL洗脱液（5.3），然后加入少许玻璃棉（5.5），用玻璃棒（4.5）将玻璃棉压 2 GB/T 37512—2019 入色谱柱底端 称取25g硅胶（5.4）于100mL烧杯中，加80mL洗脱液（5.3）制成悬浮液。通过玻璃漏斗（4.6) 将悬浮液转移至色谱柱中。 用洗脱液（5.3）冲洗烧杯，将冲洗液转移至色谱柱中，以确保将硅胶完全转移至色谱柱中。打开旋 塞，放掉洗脱液至硅胶上面1cm处。 6.1.2.2柱色谱 准确称取2.5g士0.1g油样于50mL容量瓶（4.7）中，精确至0.001g。如必要，油样可事先过滤、均 质和脱水。加人约20mL洗脱液（5.3）溶解油样。如必要，稍微加热以使其更容易溶解。冷却至室温， 用洗脱液稀释至刻度。 通过移液管转移20mL上述溶液于6.1.2.1制备的色谱柱中，打开旋塞，让溶剂洗脱至硅胶层。 用150mL洗脱液（5.3）进行色谱柱洗脱，流速约2mL/min（150mL洗脱液通过色谱柱大约需 60 min~70 min)。 流出液收集到250mL已事先恒重并准确称重（精确至0.001g）的圆底烧瓶（4.1)里。用旋转蒸发 器（4.9）除去溶剂。称重后的残留物用于制备高效液相色谱分析用溶液和制备甲酯。 榄灯油和橄榄果渣油的样品回收率应至少80%。 6.1.3固相萃取(SPE)纯化 称取0.12g样品于2mL样品瓶（4.14），准确至0.001g，加人0.5mL正已烷（5.1）溶解。 SPE柱上样，真空条件下用10mL正已烷：乙醚（87：13，体积比）洗脱。 流出液用旋转蒸发器（4.9)除去溶剂。残留物溶于2mL丙酮（5.6），用于高效液相色谱分析。 6.2高效液相色谱分析 6.2.1色谱分析试样制备 称取0.5g士0.001g样品于10mL容量瓶，用溶剂（5.9）稀释至10mL，制备成5%样品溶液，待液 相色谱分析。 6.2.2上样 设置色谱参数。以1.5mL/min速度泵入流动相（5.8）冲洗整个系统，直至基线稳定。进样10μL （6.2.1或6.1中制备的样品），洗脱至ECN52色谱峰。 6.2.3结果计算 使用峰面积归一化法，即，假定ECN42到ECN52的所有甘三酯峰面积总和为100%。按式（1)计 算每种甘三酯的相对百分含量X，以%计： A' X : :(1) 式中： A—每种甘三酯的峰面积； ZA——ECN42到ECN52所有甘三酯峰面积的和。 计算结果保留至小数点后两位。 3