ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35910—2018 猪圆环病毒 2型阻断ELISA 抗体检测方法 Blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detecting the antibody to porcine circovirus type 2 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35910—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准起草人：姜平、王先炜、白娟、杨香林、刘捷。 1 GB/T 35910—2018 猪圆环病毒2型阻断ELISA 抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪圆环病毒2型抗体阻断ELISA的检测方法。 本标准适用于猪圆环病毒病的抗体检测、疫苗免疫抗体监测和血清流行病学调查， 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（Bovine serumalbumin) ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay） HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase) PCV2:猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2） TMB：四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine) 4 仪器、材料与试剂 4.1 试验仪器 4.1.1 酶联免疫检测仪。 4.1.2 高速台式冷冻离心机。 4.1.3 微量移液器：规格0.5μL~10μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 4.1.4 12道可调微量移液器：规格10μL~100μL。 4.2 试验材料 4.2.196孔酶标反应板。 4.2.2 注射器（5mL)。 4.2.3 微量离心管（1.5mL）。 4.2.4 吸头（可与移液器配套）。 1 GB/T35910—2018 4.3主要试剂 4.3.1 PCV2重组核衣壳蛋白（Cap)抗原（见附录A）。 4.3.2辣根过氧化物酶（HRP)标记的PCV2单克隆抗体。 4.3.3PCV2阳性对照血清和阴性对照血清（见附录A）。 4.3.4四甲基联苯胺（TMB)(见附录B)。 4.3.5商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒。 5PCV2抗体阻断ELISA检测方法 5.1 样品采集、运输与保存处理 5.1.1基本要求 按NY/T541采集猪血液，按SN/T2984处理待检猪。另外，按GB19489进行检测。 5.1.2样品采集与运送 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL，凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室。若不能及 时送往实验室，则应分离血清，放人无菌微量离心管中置一20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。 5.1.3血清分离与保存 取凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清，放人无菌微量离心管中，立即用于抗体检测，或置 一20℃保存。要求血清清亮，无溶血。 5.2ELISA操作步骤 5.2.1抗原包被板的制备： a）抗原包被：用抗原包被液（见B.1)将PCV2Cap蛋白（见A.1)稀释成2.0μg/mL，加入96孔酶 标反应板，每孔100μL，置37℃2h； 一次拍干； d）加保护剂：弃去孔中液体，按5.2.1b）洗涤3次，加入抗原保护剂（见B.3），100μL/孔，置37℃ 下作用1 h； 密封：置37℃晾干，用锡箔纸真空包装，密封。 e) 5.2.2血清样品稀释和加样： 取出抗原包被板并在记录表（表1）上标记待检样品（YPi～YP，）的位置。用血清稀释液（见B.4）在 稀释板内将待检血清1：1稀释，即每孔先加50μL样品稀释液，再加50uL待检血清，混勾后，按记录 表中标记的对应于抗原包被板上的位序，依次加入到YP1、YP2、YP、…等位置的各孔中。吸取每份 血清时均应更换吸头。 待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释所有待检血清，再将稀释好的血清 转移到抗原包被板，以尽可能使反应时间一致。 2 GB/T 35910—2018 表 1 样品加样记录表（推荐模式） 2 3 4 5 6 7 10 1 8 11 12 9 YPIs YP21 YP29 A - B YPl4 YP22 + + YP3o YP1s c YPi YP, YP23 YPa1 D YP2 YPs YP16 YP24 YP32 E YP3 YPs YP17 YP25 YPa3 F YP. YPlo YPIs YP26 YPaa G YPs YPu YP19 YP27 YPas H YP. YP12 YP20 YP28 YP36 注：一为阴性对照；十为阳性对照；YPi为样品1，其余类推。 5.2.3加对照血清：用血清稀释液（见B.4)将阳性对照血清（见A.2.1）、阴性对照血清（见A.2.2)分别做 1：1稀释后，各取100uL阴性对照血清分别加入A1孔和A2孔，各取100uL阳性对照血清分别加入 B1孔和B2孔。吸取不同血清时需要更换吸头。 5.2.4混合孵育：轻轻振荡微量反应板（孔中样品勿溢出），用封条封闭，置37℃下孵育2h。 5.2.5洗涤：同5.2.1b）。 5.2.6加酶标单抗和孵育：每孔加入100μL工作浓度的HRP标记的PCV2单克隆抗体，37℃孵育 30min。该试剂使用前恢复到室温，使用后放回2℃～8℃。 5.2.7洗涤:同 5.2.1 b)。 照显蓝色、阳性对照基本不显色时，每孔加人50μL终止液（见B.7）。 5.2.9 在酶联免疫检测仪450nm波长处读取各孔的OD值数，15min内完成。 5.3结果判定 5.3.1 结果计算 阴性对照平均OD值（NCx）见式（1)： NCx=（A1孔OD值+A2孔OD值)/2 (1) 阳性对照平均OD值(PCx）见式（2)： PCx=（B1孔OD值+B2孔OD值）/2 (2 ) 样品阻断率的计算见式（3）： 阻断率（PI)=（NCx一样品OD值）/NCx×100% (3) 5.3.2判定 NCx大于0.7，PCx小于0.4时，试验条件成立。当PI≥38%判为阳性，PI≤30%判为阴性，30%< PI<38%判为可疑，对可疑样品重新检测一次，PI<38%，判为阴性。 或使用商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行。 3