ICS 65. 100.10 GB X 82 中华人民共和国国家标准 GB/T 5413.2—1997 婴幼儿配方食品和乳粉 乳清蛋白的测定 Milk powder and formula foods for infant and young children- Determination of whey protein 1997-05-28发布 1998-09-01实施 国家技术监督局 发布 GB/T 5413. 2—1997 前言 本标准参考了日本森永公司的乳清蛋白测定方法。 本系列标准从实施之日起，代替GB5413—-85， 本标准由中国轻工总会提出。 本标准由全国乳品标准化中心归口。 本标准负责起草单位：哈尔滨森永乳品有限公司、国家乳制品质量监督检验中心。 本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、雀巢（中国)投资服务有 限公司。 本标推主要起草人：于丽坤、张燕杰、赵勤 I 中华人民共和国国家标准 婴幼儿配方食品和乳粉 GB/T 5413.2—1997 乳清蛋白的测定 代替 GB 5413--85 Milk powder and formula foods for Infant and young children -Determination of whey protein 1 范围 本标推规定了酪蛋白与乳清蛋日含量比率的测定方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中酪蛋白与乳清蛋白含量比率的测定。 2方法提要 试样用SDS-聚苯烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Laemmli法)后，用光密度计对按分子量顺序分离 开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率。 3试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求,均指三级水。 3.1电泳缓冲液：将Tris(hydroxymethyl)aminomethane7.5g、甘胺酸 36g、SDS2.5g溶于蒸馏水中，定 容至500ml。使用前以蒸馏水稀释5倍后使用。 3.2SDS试样缓冲液：0.125mol/I.Trsi-盐酸(pH6.8),体积分数20%的甘油，4%(m/V)SDS,体积分 数10% 2-mercaploethanol,质量分数0.0025%的溴酚蓝(bromophnol blue)。 3. 3染色剂:质量分数0.1%考马斯蓝 R-250(Coomassic brilliant blue R-250),体积分数 10%的甲醇, 体积分数7.5%的乙酸。 3.4脱色剂：体积分数10%的甲醇，体积分数7.5%的乙酸。 3.5 酪蛋白。 3.6精制乳清蛋白（WPC)。 3.7 SDS-PAGE:用梯度凝胶(10%～20%)或同效凝胶。 4仪器 常用实验室仪器及： 4.1平板式电泳槽。 4.2供电设备。 4.3光密度计。 5操作步骤 5.1样液的制备 将试剂按蛋白质10～20μg/μL的浓度范溶解在蒸馏水中。加入与试样同体积的SDS试样缓冲 国家技术监督局1997-05-28批准 1998-09-01实施 1 GB/T 5413.2—1997 液，在煮沸热水中静置5min后，作为试样液， 5.2标准溶液的制备 使用前,酪蛋离和乳清蛋白的蛋白质浓度按凯氏(Kjeldahl)法精确测定。将酪蛋白和乳清蛋白按上 的任意比率（比如蛋白质的浓度比为75：25，50：50，25：75)进行混合作为混合标准溶液 5.3电泳 将凝胶设置在电泳槽中，加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10ul电泳时闭因 电泳凝胶的种类不同而异。以10%～20%的梯度复合凝胶进行电泳时，定电流为40mA.时间为60min 电泳结束时间可按溴酚蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液巾 振荡染色1h，然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸馏水中。 5. 4测定 以光密度计对带色的各谱带进行测定，求得其颜色深度（OD)的积分值（-Trace值）。 6分析结果的表述 6.1 谱带的测定 （1)酪蛋白：α:-酪蛋的（分子量23500）,β-酪蛋白（分子量24000），k-酪蛋白（分了量19n)00）； （2）乳清蛋白：α-乳白蛋白（分了量14000），β-乳球蛋占（分子单18000），血清白蛋百（分子量 66000). 6.2计算方法 将以上三种酪蛋白谱带的 Trace 值合计,再除以该条泳线中所有谱带的Traltt 值的总和,求得酪蛋 Trace 值的总和,求得乳清蛋白的比率(Wi值）。 当以酪蛋白与乳清蛋白的单独溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得标准酪蛋自的（，值（（ 值)与标准乳清蛋白的WI值(=W.值）。将试样的C值与W,值分别除以。值与W，值,求得暂定的 蛋H含比率(C,值)与乳清蛋白的含量比率(W，)当C2值十W：值不等于1时，将（：、W值分别除 以C,值与W²值的总和进行补整，求得试样中的酪蛋白以及乳清蛋口的比率。 当以蛋自与乳清蛋白的混合溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得各混合比率计酪滨白的 值与乳清蛋白的W，值。将混合标准溶液的C,值与酪蛋占含量比，以及W，值与乳清蛋含基比做成坐 标检量线，利用该检量线求得试样的值与W，值。当C.值+W，值不等于1，将（值、W：值分别除 以C,值与W值的总和进行补整，求得试样中酪蛋用以及乳清蛋白的比率。 2 GB/T 5413.2—1997 液，在煮沸热水中静置5min后，作为试样液， 5.2标准溶液的制备 使用前,酪蛋离和乳清蛋白的蛋白质浓度按凯氏(Kjeldahl)法精确测定。将酪蛋白和乳清蛋白按上 的任意比率（比如蛋白质的浓度比为75：25，50：50，25：75)进行混合作为混合标准溶液 5.3电泳 将凝胶设置在电泳槽中，加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10ul电泳时闭因 电泳凝胶的种类不同而异。以10%～20%的梯度复合凝胶进行电泳时，定电流为40mA.时间为60min 电泳结束时间可按溴酚蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液巾 振荡染色1h，然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸馏水中。 5. 4测定 以光密度计对带色的各谱带进行测定，求得其颜色深度（OD)的积分值（-Trace值）。 6分析结果的表述 6.1 谱带的测定 （1)酪蛋白：α:-酪蛋的（分子量23500）,β-酪蛋白（分子量24000），k-酪蛋白（分了量19n)00）； （2）乳清蛋白：α-乳白蛋白（分了量14000），β-乳球蛋占（分子单18000），血清白蛋百（分子量 66000). 6.2计算方法 将以上三种酪蛋白谱带的 Trace 值合计,再除以该条泳线中所有谱带的Traltt 值的总和,求得酪蛋 Trace 值的总和,求得乳清蛋白的比率(Wi值）。 当以酪蛋白与乳清蛋白的单独溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得标准酪蛋自的（，值（（ 值)与标准乳清蛋白的WI值(=W.值）。将试样的C值与W,值分别除以。值与W，值,求得暂定的 蛋H含比率(C,值)与乳清蛋白的含量比率(W，)当C2值十W：值不等于1时，将（：、W值分别除 以C,值与W²值的总和进行补整，求得试样中的酪蛋白以及乳清蛋口的比率。 当以蛋自与乳清蛋白的混合溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得各混合比率计酪滨白的 值与乳清蛋白的W，值。将混合标准溶液的C,值与酪蛋占含量比，以及W，值与乳清蛋含基比做成坐 标检量线，利用该检量线求得试样的值与W，值。当C.值+W，值不等于1，将（值、W：值分别除 以C,值与W值的总和进行补整，求得试样中酪蛋用以及乳清蛋白的比率。 2