ICS 67.220.20 X 60 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23535—2009 脂肪酶制剂 Lipase preparations 2009-04-27发布 2009-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23535—2009 前言 本标准以QB1805.4一1993《工业用脂肪酶制剂》为基础制定。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中国轻工业联合会提出 本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、诺维信（中国）生物技术有限公司。 本标准主要起草人：张蔚、郑海峰、郭新光、唐辰、曹振宇、康忆降， GB/T23535—2009 脂肪酶制剂 1范围 本标准规定了脂肪酶制剂的术语和定义产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、 贮存。 和销售。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T191 包装储运图示标志（GB/T191—2008ISO780：1997，MOD) 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 601 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603—2002,ISO6353-1:1982， NEQ) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 脂肪酶 lipase 能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同 时也能催化酯合成和酯交换反应的酶。 3.2 脂肪酶活力 activityof lipase 脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示，定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH条 件下，lmin水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。 4产品分类 4.1按产品的应用领域 A类产品一一食品工业和饲料工业用酶制剂。 B类产品一一其他工业用酶制剂。 4.2按产品形态 固体剂型酶制剂和液体剂型酶制剂。 5要求 5.1外观 固体剂型：白色至黄褐色粉末或颗粒，无结块、无潮解现象。无异味。有特殊发酵气味。 液体剂型：浅黄色至棕褐色液体，允许有少量凝聚物。无异味。有特殊发酵气味。 1 GB/T23535—2009 5. 2 理化要求 应符合表1的规定。 表1脂肪酶制剂的理化要求 目 固体剂型 液体剂型 酶活力"/Lu/mL(或u/g)］ 5000 干燥失重/% 8. 0 a可按供需双方合同规定的酶活力规格执行。 b不适用于颗粒产品。 5.3卫生要求 应符合国家有关规定。 6试验方法 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 6.1外观 称取样品10g（或10mL），观察、闻作出判断，做好记录。 6.2酶活力 6.2.1原理 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可 用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酰指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。 反应式为： RCOOH+NaOH-→ RCOONa + H,O 注1：酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪酶，从而使检测到的脂肪酶的活力 减小。 注2：洗涤剂的存在会严重影响本方法。依不同洗涤剂的类型和浓度不同，这种影响表现为从完全抑制到激活 注3：酶会附着在塑料上，因此应用玻璃器血溶解稀释，同时也应用玻璃器皿滴定。在溶液的转移中如果时间很短， 且选择适当的塑料材质，可以使用塑料移液枪头。 6. 2. 2 仪器和设备 6. 2. 2. 1 分光光度计 6. 2. 2.2 恒温水浴：精度士0.2℃。 自动移液器。 6.2. 2. 3 6.2.2.4高速匀浆机。 6.2.2.5pH计：精度为0.01pH单位。 6.2. 2. 6 电磁搅拌器。 6. 2. 2.7 微量滴定管：10mL，分刻度≤0.05mL。 6.2.3试剂和溶液 6.2.3.1聚乙烯醇（PVA）：聚合度1750±50。 6.2. 3.2 橄榄油：试验试剂。 6.2.3.395%（体积分数）乙醇。 6.2.3.4底物溶液： 称取聚乙烯醇（PVA)（6.2.3.1)40g（精确至0.1g），加水800mL，在沸水浴中加热，搅拌，直 至全部溶解，冷却后定容至1000mL。用干净的双层纱布过滤，取滤液备用。 量取上述滤液150mL，加橄榄油50mL，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每 2 GB/T23535—2009 次处理3min），即得乳白色PVA乳化液。该溶液现用现配。 6.2.3.5磷酸缓冲溶液（pH=7.5）：分别称取磷酸二氢钾1.96g和十二水磷酸氢二钠39.62g，用水 溶解并定容到500mL。如需要，调节溶液的pH到7.5士0.05。 6.2.3.6氢氧化钠标准溶液［c（NaOH)=0.05mol/I]：按GB/T601配制与标定。使用时，准确稀释 10倍。 6.2.3.7酚酞指示液（10g/L）：按GB/T603配制。 6.2.4分析步骤 6.2.4.1待测酶液的制备 称取酶样品1g~2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液（6.2.3.5）溶解并稀释。如果样品为粉 状，可用少量磷酸缓冲液溶解后用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中。若有剩余残 渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇 匀，转人高速匀浆机组织捣碎机捣研3min后供测定 测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL～2mL范围内 吸取样品时，应将酶液摇匀后再取 6.2.4.2测定 6.2.4.2.1电位滴定法（第一法） a）按pH计使用说明书进行仪器校正； b）取两个100mL烧杯，于空白杯（A）和样品杯（B）中各加人底物溶液（6.2.3.4）4.00mL和磷 预热5min，然后于A、B杯中各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，准确反应15min后，于 B杯中立即补加95%乙醇15.00mL终止反应，取出； 在烧杯中加人一枚转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液（6.2.3.6）滴定， 直至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 6.2.4.2.2指示剂滴定法（第二法） 冲液5.00mL，再于A瓶中加入95%乙醇15.00mL，于40℃土0.2C水浴中预热5min，然 后于A、B瓶中各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补 加95%乙醇15.0mL终止反应，取出； b）于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s 不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 6.2.4.3计算 脂肪酶制剂的酶活力按式（1）计算： ..(1) 0.05 式中： Xi——样品的酶活力，u/g; 滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； 滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； 氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； 50 -0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol； 样品的稀释倍数； 0.05 氢氧化钠标准溶液浓度换算系数； 1 反应时间15min，以1min计。 15 3