ICS 67.120 x 04 中华人民共和国国家标准 GB/T21315—2007 动物源性食品中青霉素族抗生素残留量 检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of penicillins residues in foodstuffs of animal origin- LC-MS/MS method 2008-04-01实施 2007-10-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21315—2007 前言 本标准的附录A、附录B、附录 C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：林维宣、唐英章、李一尘、赵彤彤、彭涛、田苗、于灵、李军、孙兴权 本标准为首次发布。 GB/T21315—2007 动物源性食品中青霉素族抗生素残留量 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了动物源性食品中青霉素族抗生素残留量液相色谱-质谱/质谱测定和确证方法。 本标准适用于猪肌肉、猪肝脏、猪肾脏、牛奶和鸡蛋中羟氨芋青霉素（amoxicyllin）、氨芋青霉素 （ampicillin）、邻氯青霉素（cloxacillin）、双氯青霉素（dicloxacillin）、乙氧萘胺青霉素（nafcillin）、苯唑青霉 素（oxacillin）、苄青霉素（gpenicillin）、苯氧甲基青霉素（penicillin）、苯咪青霉素（azlocillin）、甲氧苯青霉 素（methicillin）、苯氧乙基青霉素（phenethicillin)等11种青霉素族抗生素残留量的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987） 3原理 样品中青霉素族抗生素残留物用乙-水溶液提取，提取液经浓缩后，用缓冲溶液溶解，固相萃取小 柱净化，洗脱液经氮气吹干后，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682一1992规定的一级水。 4.1乙睛：高效液相色谱级。 4.2甲醇：高效液相色谱级。 4.3甲酸：高效液相色谱级。 4.4氯化钠。 4.5 氢氧化钠。 4.6 磷酸二氢钾。 4.7 磷酸氢二钾。 4.8 0.1mo/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL。 4.92 乙腈十水（15十2，体积比）。 4.10 0乙睛十水（30十70，体积比）。 4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=8.5）：称取8.7g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1000mL， 用磷酸二氢钾调节pH至8.5土0.1。 4.120.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0)：称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL， 用氢氧化钠调节pH至7.0土0.1。 4.130.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5）：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至1000mL，用甲酸 调节pH至4.5±0.1。 4.1411种青霉素族抗生素标准品：羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、乙氧茶胺青 1 GB/T21315—2007 霉素、苯唑青霉素、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、苯氧乙基青霉素，纯度均大 于等于95%。 4.1511种青霉素族抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品（4.14），分别用乙腈水溶液（4.10）溶 解并定容至100mL，各种青霉素族抗生素浓度为100μg/mL，置于一18℃冰箱避光保存，保存期5d。 4.1611种青霉素族抗生素混合标准中间溶液：分别吸取适量的标准储备液（4.15）于100mL容量瓶 中，用磷酸盐缓冲溶液（4.12)定容至刻度，配成混合标准中间溶液：各种青霉素族抗生素浓度为：羟氨 青霉素500ng/mL，氨苄青霉素200ng/mL，苯咪青霉素100ngmL，甲氧苯青霉素10ng/mL，青霉 素100ng/mL，苯氧甲基青霉素50ng/mL，苯唑青霉素200ng/mL，苯氧乙基青霉素1000ng/mL，邻 氯青霉素100ng/mL，乙氧茶青霉素200ng/mL，双氯青霉素1000ng/mL。置于一4C冰箱避光保存， 保存期5d。 4.17混合标准工作溶液：准确移取标准中间溶液（4.16)适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列的 混合标准工作溶液（用时现配）。 4.18OasisHLB固相萃取小柱，或相当者：500mg，6mL。使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲 醇淋洗小柱，然后用1mL水淋洗小柱。 5仪器 5.2旋转蒸发器。 5.3固相萃取装置。 5.4离心机。 5.5均质器。 5.6旋涡混合器。 5.7 pH计。 5.8氮吹仪。 6试样制备与保存 取代表性样品，用组织捣碎机充分捣碎，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻 存放。 7检测步骤 7.1提取 7.1.1肝脏、肾脏、肌肉组织、鸡蛋样品 称取约5g试样（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人15mL乙睛水溶液（4.9），均质30s， 4000r/min离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加入10mL乙水溶液（4.9）， 洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡 1min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液（4.9）洗涤刀 头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙睛水溶液（4.9）定容至40mL。准确移取20mL入 100mL鸡心瓶。 7.1.2牛奶样品 称取10g样品（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙腈（4.9），均质提取30s， 4000r/min离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加入10mL乙水溶液（4.9）： 洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡 1min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙睛水溶液（4.9）洗涤刀 2 GB/T21315—2007 头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙睛水溶液（4.9）定容至50mL。准确移取25mL入 100mL鸡心瓶。 将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37℃水浴）蒸发除去乙睛（易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液）。 7.2净化 立即向已除去乙睛的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11），涡旋混匀1min，用0.1mol/l 氢氧化钠调节pH为8.5以1mL/min的速度通过经过预处理的固相萃取柱，先用2mL磷酸盐缓冲溶 液（4.11）淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗，然后用3mL乙洗脱（速度控制在1mL/min）。将洗脱液 于45C下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至1mL，过0.45μum滤膜后，立即用 液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 7.3.1.1色谱柱：Cls柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5um，或相当者。 7.3.1.2流动相：A组分是0.01mol/L乙酸铵溶液（甲酸调pH至4.5）；B组分是乙。梯度洗脱程 序见表1。 表1梯度洗脱程序 步骤 时间/min 流速/(mL/min) 组分A/% 组分B/% 1 0.00 1. 0 98.0 2.0 2 3.00 1. 0 98. 0 2.0 3 5.00 1.0 90.0 10.0 4 15. 00 1. 0 70.0 30.0 5 20.00 1. 0 60.0 40.0 6 20. 10 1. 0 98. 0 2. 0 7 30.00 1.0 98. 0 2. 0 7. 3. 1. 3 流速：1.0mL/min。 7.3.1.4进样量：100μuL。 7.3.2质谱条件 7.3.2.1离子源：电喷雾离子源。 7.3.2.2扫描方式：正离子扫描。 SAC 7.3.2.3检测方式：多反应监测。 7.3.2.4雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测 要求，参考条件见附录A。 7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。标准工作液和 待测液中青霉素族抗生素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积进行测 定。在上述色谱条件下，11种青霉素的参考保留时间分别约为：羟氨苄青霉素8.5min，氨芊青霉素 12.2min，苯咪青霉素16.5min，甲氧苯青霉素16.8min，苄青霉素18.1min，苯氧甲基青霉素 22.3min，双氯青霉素23.5min。青霉素族抗生素标准溶液的定量离子对重构离子色谱图见图B.1。 7.3.4定性测定 液相比在土2.5%的允许偏差之内；待测化合物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3 3