ICS 67.120 X 04 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 21313—2007 动物源性食品中β-受体激动剂残留 检测方法氵 液相色谱-质谱/质谱法 Analysis of β-agonists in foods of animal origin by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2007-10-29发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21313—2007 前言 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心营 养与食品安全所。 本标准主要起草人：邵兵、李晓娟、吴永宁、彭涛、孟娟、杨奕、代汉慧、国伟。 本标准为首次发布， GB/T21313—2007 动物源性食品中β-受体激动剂残留 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了β-受体激动剂类兽药残留检测的制样方法和液相色谱-质谱/质谱确证方法。 本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品以及猪尿中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它 林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁等8种β-受体激动剂类残留量的高效液相色谱-质谱/质 谱测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3方法提要 试样中β受体激动剂残留经酶解后，再用高氯酸溶液提取，经过滤和离心后，上清液用HLB和 MCX固相萃取柱净化，液相色谱/串联质谱仪测定，外标峰面积法定量。 4制样方法 制样操作过程中应防止样品污染或残留物发生变化。 4.1动物肌肉、肝脏、肾脏 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，剔除筋膜，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装人洁净容 器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻存放。 4.2猪尿 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于 一18℃以下冷冻存放。 5试剂和材料 除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1甲醇。 5.2高氯酸：分析纯。 5.3氨水：分析纯（浓度25%28%）。 5.4甲酸(99%,ameisensaeure)。 5.5氢氧化钠：分析纯。 5.6乙酸：分析纯。 5.7乙酸钠(NaAc·4H,O)：分析纯。 5.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.2）：称取43.0gNaAc·4H,O和25.2g乙酸，加水溶解并定容到 100 mL。 1 GB/T21313—2007 5.90.1%甲酸水溶液。 5.105%甲醇氨溶液：量取5mL氨水（5.3），用甲醇定容至100mL。 5.1120%甲醇水溶液 5.120.1mol/L高氯酸。 5.130.1mmol/L高氯酸。 5.14β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液（β-glucuronidase/arylsulfatase）（30U/mL）。 5.15标准物质：妥布特罗（tulobuterol,CAS：41570-61-0）、特布它林（terbutaline，CAS：23031-25-6）、 沙丁胺醇（salbutamolCAS：51022-70-9），非诺特罗（fenoterol，CAS：1944-12-3）、福莫特罗（formoterol， CAS：73573-87-2）、克伦特罗（clenbuterol.CAS：37148-27-9），莱克多巴胺（ractopamine，CAS：97825-25-7）、 异丙喘宁（metaproterenol,CAS：586-06-1）。纯度均大于等于99%。 5.16标准溶液 5.16.1标准储备溶液：准确称取克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克 多巴胺、异丙喘宁各0.0100g，分别用甲醇溶解并定容至10mL，浓度为1000mg/L，一18℃冰箱中保 存，有效期12个月。 5.16.2标准工作液：根据需要，用甲醇将标准储备溶液（5.16.1）配制为适当浓度的标准工作液。标准 工作液应使用前配制。 5.17HLB固相萃取柱（500mg，6mL）或其他等效柱。 5.18MCX固相萃取柱（60mg，3mL)或其他等效柱。 6仪器 6.1高效液相色谱-串联质谱仪。 6.2 电子天平：感量0.0001g。 6.3 3电子天平：感量0.01g。 6.4 组织勾浆机。 6.5旋涡混合器。 6.6冷冻离心机（最大转速高于10000r/min）。 6.7 聚丙烯离心管（50mL）。 6.8 酸度计(0.01)。 6.9氮吹仪。 6.10固相萃取仪。 6.11超声清洗仪（功率5W）。 7提取及净化 7.1提取 准确称取10.0g样品，加人15mLpH5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.8），1000r/min匀浆1min， 再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液100μL，于37℃土1℃振荡酶解过夜。取出冷却后，用高 氯酸调pH值至1.0，超声振荡20min，取出置于80℃水浴中加热30min。放人冷冻离心机中，10℃ 10000r/min离心10min。倾出上清液，残渣再用10mL0.1mol/L高氯酸溶液提取一次，10000r/min 离心。合并上清液。用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至4.0,此溶液待过HLB固相萃取柱。 7.2净化 7.2.1HLB柱净化 HLB固相萃取柱（5.17），使用前用6mL甲醇、6mL水活化。将7.1提取的溶液以2mL/min~ 3mL/min的速度过柱，弃去滤液，用2mL5%甲醇淋洗，小柱抽干，再用6mL甲醇洗脱。洗脱液用氮 2 GB/T21313—2007 气吹至近干。用3mL0.1mmol/L高氯酸溶液溶解残渣，供MCX柱净化用 7.2.2MCX柱净化 MCX柱（5.18)，使用前用3mL5%甲醇氨、3mL甲醇、3mL水、3mL0.1mmol/L高氯酸（pH4.0) 溶液活化。将7.2.1制得的溶液过柱，弃去滤液，依次用1mL甲醇、1mL2%甲醇水溶液淋洗，最后用 1 min，用于HPLC-MS/MS测定。 7.3基质加标标准工作曲线的制备 将混合标准工作液（5.16.2)用初始流动相逐级稀释成0.5μg/L～50.0μg/L的标准系列溶液。称 取与试样基质相应的阴性样品10.0g，加人标准系列溶液1.0mL，按照7.1、7.2与试样同时进行提取 和净化。 8液相色谱-质谱/质谱测定 8.1液相色谱条件 8.1.1色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHCis柱(100mmX2.1mm,1.7μm)或其他等效柱。 8.1.2流动相：甲醇-0.1%甲酸水梯度淋洗，参考梯度条件见表B.1。 8.1.3流速：300μL/min。 8.1.4柱温：40℃。 8.1.5进样量：10μL 8.2质谱参考条件 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI十）；质谱扫描方式：多反应离子监测（MRM）；其他参考 质谱条件见附录A。 9定性 9.1保留时间 试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在土2.5%之 内。各化合物的参考保留时间见表B.2。 9.2信噪比 待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子 色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。 9.3定量离子、定性离子及子离子丰度比 每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次， 对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其充许偏差 不超过表1规定的范围。各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录C、附录D。 表1定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 10定量 按式（1）计算残留量： (1) mX1000 3