ICS 67.120 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T21321—2007 动物源食品中阿维菌素类药物 残留量的测定 免疫亲和-液相色谱法 Determination of avermectins residues in foodstuffs of animal origin- Immunoaffinity-high performance liquid chromatograph 2007-10-29发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21321—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、李建成、曹兴元、王战辉、李晓薇、丁双阳、吴聪明、彭涛、国伟。 GB/T21321—2007 动物源食品中阿维菌素类药物 残留量的测定 免疫亲和-液相色谱法 1范围 本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量检测的免疫亲和-液相色谱法。 本标准适用于牛肝脏和牛肌肉组织样品中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃普利诺菌素残留量的 测定。 本标准的方法检测限：阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃普利诺菌素均为1ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， 3原理 干，衍生化后，用高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3磷酸二氢钾。 4.4氯化钾。 4.5 磷酸氢二钠（NazHPO·12H2O）。 4.6 氯化钠。 4.7乙酸酐。 SNG 4.8 1-N-甲基咪唑：含量≥99%。 4.9埃普利诺菌素标准品：纯度98%。 4. 10 阿维菌素标准品：纯度≥98%。 4.11多拉菌素标准品：纯度≥94.3%。 4.12伊维菌素标准品：纯度≥98%。 4.13免疫亲和色谱柱（IAC柱）：长4cm，内径1cm,IAC凝胶体积为1mL。 4.14组织稀释液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。称取磷酸二氢钾（4.3）0.2g、氯化钾（4.4） 0.2g、磷酸氢二钠（4.5）2.9g、氯化钠（4.6）8.8g，用水溶解并稀释至1L。 4.15洗涤液：A液、B液和C液。A液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液（4.14）+甲醇（80+20，体积比）； B液为20%甲醇溶液；C液为50%甲醇溶液 1 GB/T21321—2007 4.16衍生化A液：1-N-甲基咪唑十乙（2十5，体积比），现配现用。 4.17衍生化B液：乙酸酐十乙睛（3十4，体积比），现配现用。 4.18埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准储备液：100μg/mL。准确称取适量埃普利 诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品（4.9～4.12），分别用乙睛配成100ug/mL的标准储备 液。一20℃保存六个月。 4.19混合标准储备液：1μg/mL。取四种标准储备液（4.18）各1.0mL于100mL容量瓶中，用乙睛 溶解并稀释至刻度，4℃保存三个月。 4.20标准工作液：分别量取适量上述混合标准储备液（4.19），用乙睛稀释成浓度为1、5、10、20、50、 100和200ng/mL的系列标准溶液 5仪器 5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。 5.2 组织匀浆机。 5.3离心机。 5.4旋转蒸发仪。 5.5涡动仪。 5.6氮吹仪。 5.7恒温加热器。 6试样制备与保存 取新鲜或解冻的动物组织，剪碎，10000r/min匀浆1min。一20℃下保存。 7分析步骤 7.1提取 称取试样1g（精确到0.01g），于30mL离心管中，加4mL甲醇，涡动1min，300r/min振荡 30min，3000r/min离心10min，取上清液。残渣用4mL甲醇重复提取1次，合并两次提取液 7.2净化 提取液中加20mL组织稀释液（4.14），涡动混合均匀后，过IAC柱，自然重力下流出，依次用洗涤 液A液20mLB液15mL和C液3mL（4.15）洗涤，用4mL甲醇洗脱于试管中，40℃氮气吹干。 7.3衍生化 试样残渣中加100μL衍生化A液（4.16），涡动0.5min，再加100aL衍生化B液（4.17），涡动 0.5min，密闭，于96℃恒温箱中衍生化反应100min。取出，冷却至室温，用乙睛稀释至2.5ml.寸 0.2μm滤膜，进行HPLC分析。 注：标准溶液经氮气吹干后同法进行衍生化操作。 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱：Cis，250mm×4.6mm，粒径5μm，或相当者。 流动相：甲醇十水（97十3，体积比）。 流速：1 mL/min。 柱温：30℃。 进样量：20μL。 激发波长：365nm。 发射波长：475nm。 2 GB/T 21321—2007 7. 4. 2 液相色谱测定 分别取适量衍生化后的试样液和标准工作液进行液相色谱测定，做单点校准或多点校准，以色谱峰 的峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之 内。试样液测定过程中应参插标准工作液，以便准确定量。标准品液相色谱图见附录A。 8 结果计算 按式（1）计算试样中阿维菌素类药物的含量。 JXS=X ...(1) m 式中： X一试样中阿维菌素类药物的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； c——试样液色谱峰对应的阿维菌素类药物浓度，单位为微克每升（μg/L)； f—稀释倍数； m一试样质量，单位为克（g） 注：测定结果用平行测定后的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后两位、 9 精密度 本方法的批内变异系数≤20%，批间变异系数≤30%。