ICS 67.120.99 B 45 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T21166—2007 肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolites residues in casing- LC-MS/MS method 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21166—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 本标准主要起草人：陈惠兰、丁涛、沈崇钰、吴斌、徐锦忠、林宏、李公海、张扬、蒋原、蔡宝亮、陶宏锦 GB/T21166—2007 肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了肠衣中呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（简称AMOZ）、喃西 林的代谢物氨基脲（简称SEM)、呋喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲（简称AHD)和呋喃唑酮的代谢物 3-氨基-2-嗯唑烷基酮（简称AOZ)残留量的液相色谱-串联质谱的测定方法。 本标准适用于肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 3方法提要 硝基喃类药物在动物体内迅速分解，其原位稳定性只有数小时，而其代谢物在动物体内容易和蛋 白组织结合，十分稳定。在酸性条件下，与蛋白质组织键合的硝基喃类药物代谢物游离出来，与衍生 化试剂避光衍生化16h，乙酸乙酯提取后，浓缩定容，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。 4试剂和材料 4.1水：应符合GB/T6682规定的一级水。 4.2甲醇：HPLC级。 4.3Z 乙酸乙酯：HPLC级。 4.4 乙酸铵：HPLC级。 4.5无水磷酸氢二钾：分析纯。 4. 6 6二甲基亚砜：分析纯 4.7 邻硝基苯甲醛：分析纯。 4.8盐酸：36%~38%分析纯。 4.9同位素内标：AHD-13C3,AMOZ-D5,AOZ-D4,SEM·HCI-(13C,15N2),100μg/mL，纯度≥98%。 4.10AOZ、SEM·HCI、AMOZ和AHD·HCI标准品：纯度≥98%。 4.11AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准储备溶液：1mg/mL。准确称取适量的AOZ、SEM·HCl、 AMOZ和AHD·HCI标准品（4.10）.用甲醇（4.2）配成1.0mg/mL的标准储备液。储备液贮存在 4℃冰箱中,1年有效。 4.12AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准工作溶液：用甲醇分别配成浓度为100ng/mL、10ng/mL标准 工作溶液，标准工作溶液在4℃保存，3个月有效。 4.13内标溶液：用甲醇配制浓度为50ng/mL四种内标混合溶液，内标混合溶液在4℃保存，1年 有效。 4.14衍生化溶液：50mmol/L邻硝基苯甲醛。称取0.0378g的邻硝基苯甲醛（4.7）到50mL烧杯 1 GB/T211662007 中，加人5mL二甲基亚砜（4.6)溶解，现配。 4.15磷酸氢二钾缓冲液（1mol/L）：称取87.1g无水磷酸氢二钾（4.5），加500mL水溶解。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪（串联四极杆）：配有电喷雾离子源。 5. 3 旋转蒸发仪或相当者。 5.4水浴振荡器。 5.5 旋涡混匀器。 5.6 贮液器：50mL。 5.7真空泵：真空度应达到80kPa 5.8离心机。 5.9禾 移液器：5mL，200μL。 5. 10 离心管：50mL，具塞。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 将实验室样品绞碎均匀，分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品袋中，密封，并做上标记 6.2试样保存 将试样于冷冻状态下保存（一18℃）。 SAG 7测定步骤 7.1提取 准确称取2.00g试样，置于50mL具塞离心管中，准确加入0.100mL50ng/mL四种内标混合溶 液（4.13）、4mL水、0.5mL1mol/LHCl、150μL邻硝基苯甲醛溶液（4.14），于旋涡混匀器上快速混合 30S，37℃水浴振荡过夜（16h）。取出样品，冷却到室温后，加入3.5mL磷酸氢二钾缓冲溶液（4.15）， 调节样品溶液pH7～7.5。加人8mL乙酸乙酯，混合30s，2500r/min离心5min，取上层乙酸乙酯溶 液到50mL玻璃试管中，再加人8mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40℃水浴旋转蒸发 干。用甲醇水溶液（4十6)1.0mL定容，过0.45μm的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2标准溶液的衍生化 分别准确移取100ng/mL和10ng/mL四种标准混合溶液（4.12)0.20mL、0.10mL和0.050mL 到相应干净的50mL玻璃离心管中，准确加人0.100mL四种标准内标混合溶液（4.13）、0.5mL1mol/L HCl、150uL邻硝基苯甲醛溶液（4.14），于旋涡混匀器上快速混合30s，37C水浴振荡过夜（16h）。按 照样品提取步骤处理（7.1)后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1 参考液相色谱条件 色谱柱：Cis，5μm，150mm×2.1mm（内径），或相当者； 流动相：甲醇（A）+0.5mmol/L乙酸铵水溶液（B）； c) 流速：0.25mL/min； 梯度洗脱程序：0min~6.0min20%~60%A,6min~8min60%A,8min~9min60%~ 80%A,9min~9.1min80%~20%A,9.1min~10.5min20%A; e) 柱温：室温； f）进样量：25μL。 2 GB/T21166—2007 7.3.2 串联质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子化电离源（ESI），正离子监测； b) 扫描方式：选择离子检测（SRM）； 雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氨气； c) d) 喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度； e) 选择离子对见表1。 表1选择离子对 母离子 子离子 测定物质 (m/z) (m/z) 134.0* AOZ 236.0 104.0 AOZ-D4 240.0 134.0 166.0* SEM 209.0 192.0 212.0 168.0* SEM-(1"C,1'N2) 134 AHD 249.0 178 AHD-13C3 252.0 134a 291a AMOZ 335.0 262 AMOZ-D5 340.0 296.0a 定量离子。 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 衍生化后的标准工作溶液（7.2)在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面 积比值为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线（0.5ng/ml~20ng/mL）， 用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色 谱条件下，其相应的标准物质、内标色谱图和串联质谱图参见图A.1和图A2。 7.4空白试验 除不加入试样外，按上述步骤进行。 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式（1)计算样品中硝基呋喃代谢物的浓度，结果需扣除空白值： Ax·m. Cx= A..m 式中： 样品中硝基呋喃代谢物的浓度，单位为微克每千克（μg/kg)； * Ax一一样品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； 硝基呋喃代谢物标准的质量，单位为纳克（ng）； A. 一标准品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； 样品质量，单位为克（g）。 m- 3